猪附红细胞体eno基因可视化LAMP检测方法的建立与应用

摘要

为建立一种快速、便捷、可基层现场检测猪附红细胞体(M.suis)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究参考GenBank已登录的M.suis基因组(NC_015153),以其α-烯醇化酶(eno)基因为目的基因设计合成4条特异引物,经反应条件优化,初步建立了检测M.suis的LAMP方法,其内外引物比为1:6,可在63℃,反应50 min时通过SYBR Green I染料直接经肉眼判定结果.利用该方法检测弓形虫、大肠杆菌、猪链球菌I型、牛源瑟氏泰勒虫和M.suis,结果显示均无交叉反应,特异性强;将新提取的重组质粒pMD-eno 10倍倍比稀释(100～10-7),利用本研究建立的LAMP方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对重组质粒pMD-eno最低检测限为30拷贝/μL,比普通PCR检测方法敏感度高100倍,敏感性高;利用建立的LAMP方法对同一时间和不同时间提取的M.suis基因组(101～106)进行组内组间重复试验,结果显示组内与组间检测结果均为阳性,重复性好.利用该方法对84份疑似感染M.suis的猪血液样品进行检测,结果显示LAMP检测结果与PCR方法检测结果一致,表明本研究建立的LAMP检测方法可应用于M.suis临床样品检测.本研究建立的LAMP方法操作简单、特异、灵敏和重复性好,经肉眼可判读结果,适合猪场M.suis感染的现场检测.