一种新颖酶联－环介导等温基因扩增技术(E－LAMP)的建立与应用

摘要

本发明属于生物技术应用领域，涉及人类医学及兽医，包括RNA病毒在各种生物制品、献血员、病人血液标本等的检测。具体是应用酶联－环介导等温扩增技术(E－LAMP)，通过计算机软件分析HCV RNA病毒保守和病毒特异性基因序列，设计出六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配，只需一步就可完成在等温环境中的循环置换扩增反应，同时将普通的酶联免疫技术与RT－LAMP有机结合，通过对不同引物进行生物素标记将RT－LAMP的中产物固相到包被有链酶亲和素的微孔反应板上，再通过HRP酶标抗Digoxin抗体与标记在另一条引物上的Digoxin特异性结合而最终呈现颜色反应。实现了在单管中完成从扩增到结果呈现的全部检测过程。与传统的RT－PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。

说明书

技术领域

本发明是酶联-环介导等温扩增技术(E-LAMP)用于HCV RNA病毒检测。用于RNA病毒在各种生物制品、献血者、病人血液标本等的监测。应用范围包括人用、兽用及其他生物防御用。

背景技术

1、病毒基因检测技术的现状

自核酸的体外扩增变为现实以来，各种核酸扩增酶与核酸扩增方法层出不穷，基因诊断技术也被愈加广泛地用于疾病监控、基因突变和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因扩增放大方法主要有最广泛使用的PCR、bDNA、SDA、3SR、NASBA等。尽管这些方法都具有很强的核酸放大能力，但在仪器需求和实验的可操作性方面存在很多弊端。臂如：PCR需要对双链进行热变性过程才能启动下一轮的扩增反应；在NASBA和3SR技术中通过一些特殊的转录和反转录过程才能进行核酸的扩增，虽然省去了核酸的变复性过程，但在引物设计时还要加入转录酶的特异性结合位点；SDA和bDNA检测技术则通过特殊内切酶的使用在等温条件下进行核酸扩增和信号放大。

相形之下，两种近年发展起来的环介导等温基因扩增检测技术，即环介导等温扩增技术(LAMP)与滚环复制放大技术(RCA)，具有更高的灵敏度和特异性，而且在扩增时间和可操作性方面显示出强大优势。在这两种技术中分别使用了特异对应于靶序列的引物或探针，在连接酶(或反转录酶)和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增。整个扩增反应并不需要核酸的变复性过程和特殊仪器，在1.5-3小时内即可完成。这两种检测技术在可操作性、灵敏度以及特异性方面表现出来的优越性使其倍受研究者的青睐，并已成功应用于各种基因的检测。

2、丙型肝炎病毒

全世界有1.7亿HCV的慢性感染者，每年新增10万人以上的肝癌患者。众所周知，肝癌与慢性肝炎是密不可分的。根据WHO在2002年发布的一项报告显示，在2001年由于慢性肝炎引起的死亡人数达到140万，其中至少20％(28万人以上)是因丙型肝炎引起的。尽管在丙型肝炎的诊断和治疗方面的研究已经有了长足的进展，但在发展中国家，由于丙型肝炎不能得到及时的诊断和治疗而引起的病死率还在不断增加。HCV感染的诊断主要依赖于血清抗体的ELISA检测和病毒基因的检测，但由于感染初期抗体水平很低，抗体的检测总会使一些窗口期传染源漏检，尤其在免疫抑制型患者(如合并HIV感染的患者)中更易表现为假阴性，而利用抗体检测核心抗原的技术一直是一个很难突破的瓶颈。基于PCR的基因检测技术(NAT)具有更高的灵敏度，尤其在转氨酶为正常水平，抗体尚未出现时，此技术便成为一种可信赖的丙型肝炎实验室诊断方法。因此，欧洲药管局已将HCV-RNA的检测列为HCV病毒检测的强制执行项目。在丙型肝炎的传播中输血也是一个最重要的途径之一，这为丙型肝炎的预防工作带来很大压力。虽然通过对献血员严格的监测和筛查使这种危险已大幅度减弱，但在输血过程中丙肝病毒传播“零危险”的目标也很难达到。随着NAT技术的日趋完善，一些发达国家已将此技术用于血库的常规筛查项目，这使窗口期病人的漏检率有了显著的降低。据报道，较免疫学检测，NAT技术可将HCV的平均窗口期提前25天以上，使献血员传播HCV的概率降低72％左右。因此，现阶段在世界范围内开展大规模血液筛查也多采用NAT技术。

目前HCV的NAT检测中，PCR和荧光PCR(TaqMan)最为常见。虽然这两种技术检测灵敏度高，但因其费用昂贵、操作复杂，在发展中国家很难作为血库的常规检测推广。因此，简化操作手段和缩短检测时间成为发展和改造基因检测方法的重点，本发明中所研究和建立的方法正是迎合这两个重点进行的。

3、逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)最初由Notomi等人设计并应用于病毒检测。在检测过程中核酸链通过等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大。由于反应中使用了三对特异性引物，只有在三对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。其中一对引物的5′端含有一段与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行。相对于其他传统扩增方法，尤其对RNA的扩增，这种扩增很大程度上提高了检测的灵敏度并节省了反应时间。因为其中的一对引物专门用于增加扩增模板减少反应时间，加之反转录和扩增反应在等温统一环境中一步完成，省去了反转录步骤和改变温度所需的时间。整个检测过程在65℃等温条件下只需1-2小时就可完成。最终的扩增产物在核酸电泳的凝胶上呈现出典型的阶梯状条带。值得一提的是RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁沉淀，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。

4、LAMP在病毒基因检测方面的应用

基因诊断技术被广泛地用于疾病监控，基因突变和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因扩增放大的方法主要有最广泛使用的PCR，支链DNA扩增技术(bDNA)，自主复制系统(3SR)，基于核酸序列的放大系统(NASBA)，这些技术在基因检测方面都有各自的扩增特点和优劣性。臂如，PCR需要对双链进行升温变性过程后才能启动下一轮的扩增反应。在NASBA和3SR技术中虽然省去了核酸的变复性过程，但也需要通过一些特殊的转录和反转录过程进行核酸的扩增；SDA和bDNA检测技术则通过特殊的内切酶等的使用在等温条件下进行核酸扩增和信号放大。文中表1总结和比较了近年来发展起来的一些扩增技术的基本特征。

表1.不同核酸扩增技术的特征

尽管这些方法都具有很强的放大能力，但在仪器需求和可操作性方面都存在不同的弊端。而LAMP检测技术无论在可操作性、灵敏度以及特异性方面表现出来的优越性使其越来越受到研究者们的青睐。近年来已有许多在基因检测方面成功应用的报道。

在病毒基因检测方面，Parida等人利用RT-LAMP技术检测了西尼罗病毒的RNA，并与普通RT-PCR进行了灵敏度比较，发现RT-LAMP的灵敏度高于RT-PCR方法10倍以上。在SARS病毒的检测中Thai等人也将常规RT-PCR与RT-LAMP作了比较，它们的样本检出率分别为87％和100％，而且他们的实验结果证明了RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍。与此同时，其他研究者利用该技术进行了麻疹、新城疫和口蹄疫等病毒的检测。LAMP也被成功用于检测过不同的植物病毒，如Fukuta等人利用该技术成功的检测了菊花中的番茄斑枯病毒和繁殖体中的山药嵌纹病毒。

LAMP技术在病毒基因检测方面的优势已毋庸置疑，因其具有独特的核酸扩增机制，使该技术在其它检测领域也拥有广泛的应用前景。最近已有不少学者在这方面作了许多有益的尝试。Fukuta等人在检测菊花中的番茄斑枯病毒就将免疫捕捉技术与RT-LAMP有机结合并获得了成功。还有人分别报道了利用该技术检测虹鳟鱼造血组织坏死病毒、出血性败血症病毒和犬瘟病毒的实例。为了发展可供临床上使用且简便易行的基因检测技术，Notomi的研究小组预先将可与LAMP中产物杂交的探针进行荧光标记，并在LAMP反应体系中加入了阳离子聚合物聚乙烯胺(PEI)，最终可与扩增产物形成复合物沉淀，而杂交至扩增产物上的荧光标记物使该沉淀在紫外光下呈现出不同的颜色，进一步方便了LAMP技术在临床监测中的应用。由于LAMP扩增可在短时间内产生大于500μg/ml的DNA，因此这个研究组还使用特异寡核苷酸引物和TspR1内切酶以LAMP的特异性产物为模板扩增出特异性的单链DNA，这种方法的成功也为LAMP与微阵列等技术的结合提供了可行性依据。另外，还有该技术被用于寄生虫、细菌以及病原基因分型检测(如登革热病毒的分型)、胚胎性别检测和SNP研究的报道。如Oriel等人就曾利用LAMP技术从实验感染的猪体内成功检出了可引起伊凡斯锥虫病的寄生虫的基因。同时，还有肺炎链球菌lyt A基因和爱德华氏菌被成功检测的报道。该技术也可对移植牛胚的性别作出快速鉴定。

从上述LAMP的原理和特点不难看出，这种扩增技术在检测特异性以及便捷性和灵敏度方面都具有很强的优势，这种优势是其它扩增技术无法比拟的。不过它在结果判定方面仍然不能避免核酸电泳带来的麻烦和安全性方面的威胁，而且这种方法很难界定一些微量模板检测结果的判断。目前，为了克服这些弊端，完善此项技术，该技术最初的研究者又开发了一种浊度监控仪，可以通过判断扩增过程中形成焦磷酸镁沉淀的浊度来对反应实施监控和进行结果判断。但这种仪器类似于Real-time PCR仪，操作比较复杂而且价格也比较昂贵，很难作为一种常规检测技术进行推广。

5、酶联-环介导等温基因扩增技术(E-LAMP)

本发明将普通的酶联免疫技术与RT-LAMP有机结合，也一并引入了固相载体技术，通过对一条引物进行生物素标记，将RT-LAMP的中产物固相到包被有链霉亲和素的微孔反应板上，再通过辣根过氧化物酶(HRP)标记抗地高辛(Digoxin)抗体与标记在另一条引物上的地高辛特异性结合而最终呈现颜色反应，实现了在单管中完成从扩增到结果呈现的全部检测过程。它的检测时间可以缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。基于酶联-环介导等温扩增技术的这一检测系统在灵敏度和和特异性方面与普通RT-PCR相同，但其与酶联免疫技术的巧妙结合，使对实验硬件设备的要求大大降低，只需一个恒温水浴箱和一台酶标仪即可满足整个实验需求。与普通RT-PCR或RT-LAMP相比，在可操作性上显示出更大的优势，更易于推广。

发明内容

1、一种新颖酶联-环介导等温基因扩增技术(E-LAMP)的建立

本发明旨在克服当前在病毒基因检测过程中存在的操作复杂、RNA酶和核酸扩增污染严重、实验硬件设备要求高、价格昂贵等缺点而设计的一种新颖酶联-环介导等温基因扩增技术(E-LAMP)。

1.1.如发明内容1.所述的一种新颖酶联-环介导等温基因扩增技术(E-LAMP)，其特征在于，将普通的酶联免疫技术与RT-LAMP有机结合，也一并引入了固相载体技术。

1.2.如发明内容1.1所述的新颖酶联-环介导等温基因扩增技术(E-LAMP)将普通的酶联免疫技术与RT-LAMP有机结合，其特征在于，将RT-LAMP的中产物固相到包被有链霉亲和素的微孔板上，再通过酶标二抗而最终呈现颜色反应。

1.3.如发明内容1.2所述的通过酶标二抗呈现颜色反应，是指通过辣根过氧化物酶(HRP)标记抗地高辛(Digoxin)抗体与标记在引物上的地高辛特异性结合而呈现颜色反应，实现了在单管中完成从扩增到结果呈现的全部检测过程。

2、引物设计

通过Blast、AlignX和Primer5.0程序、选择丙型肝炎病毒HCV的5′UTR区，对保守区分别设计了六条引物，其中包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)和两条环结合引物(Loop1、Loop2)。所有引物的具体序列见表2。

表2.E-LAMP检测HCV的引物序列

2.1.如发明内容2.所述的引物，其特征在于反应中使用了三对特异性引物，只有在三对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。

2.2.如发明内容2.所述的引物，其特征在于其中一对引物的5′端含有一段与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行。

2.3.如发明内容2.所述的引物，其特征还在于对其中一条内引物(FIP)在5′端进行生物素标记。

2.4.如发明内容2.所述的引物，其特征还在于对其中另一条内引物(BIP)在5′端进行地高辛标记。

3、建立了如下的检测过程

3.1.合成探针：使用大连宝生物生物技术公司合成仪合成。

3.2.将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。

3.3.进行酶联-环介导等温扩增(E-LAMP)反应。

3.4.酶标仪中读值。

本发明特点

这种新颖酶联-环介导等温基因扩增技术(E-LAMP)将检测时间缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子，除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。这种改进后的LAMP检测技术可以对核酸检测样品进行半定量。本发明是目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势，这主要体现在以下几个方面：

第一，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，从而使检测特异性得到改善。

第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检

测的敏感性和安全性。

第三，所有的扩增过程都可在65℃同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。

第四，通过酶标技术可将检测的阳性结果用颜色反应呈现出来。

第五，在结果判断方面，借鉴酶联免疫技术的结果判断方法，通过实验验证并建立了可靠的结果判断系统。

第六，通过普通酶标仪对反应颜色的检测可以对样品进行半定量的测定。

第七，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。

具体实施方式

实施方案1：丙型肝炎病毒基因(HCV)的E-LAMP检测

(1)以5μg/ml的包被浓度在酶标板或微孔反应板上包被链酶亲和素，每孔加入100μl，4℃过夜，拍干酶标板，待用。

(2)以PBS洗板，再用1％的BSA37℃封闭1h，洗板，-20℃贮存备用。

(3)加入带有标记引物的E-LAMP反应体系，63℃扩增1.5h。

E-LAMP的反应体系如下：F3与B3，5pmol；BIP与FIP，40pmol；Loop-1与Loop-2，20pmol；其它反应组分终浓度为1.0mM dNTP，1mM betaine，6mMMgSO4，2.5μl 10×Bst-DNA Polymerase Buffer，8U Bst-DNA polymerase，1UAMV反转录酶，5μ1HCV RNA样品，补水至25μl，混匀，63℃，水浴1.5h。

(4)移去孔中反应液，洗板。

(5)加入HRP标记抗Digoxin抗体(1∶10000)，37℃继续放置40min。

(6)移去孔中反应液，用洗液洗3-5次。

(7)加入显色液A+B，37℃避光放置2-3min，显色。

(8)显色完成后加入终止液(1N硫酸)终止反应。在酶标仪中读值(双波长405nm，630nm)。

实施方案2：对E-LAMP方案进行灵敏度测试

为了验证E-LAMP的半定量效果和作为常规基因检测的可行性，对一份定量后的HCVRNA样品进行10倍系列稀释，利用稀释的样品测试E-LAMP方案的灵敏度，具体操作程序按HCV-E-LAMP的检测步骤进行。测试结果表明该方法的灵敏度理论上可达到检测10个拷贝的HCV cDNA分子，此灵敏度水平与普通RT-LAMP相同，证明该技术经过改造后，其灵敏度并没受到影响。

实施方案3：E-LAMP检测HCV病毒的特异性

方法与丙型肝炎病毒基因(HCV)的E-LAMP检测相同，使用的RNA样品改为HIV、HBV。实验结果表明HIV和HBV的OD值均趋于阴性，证明这种检测方法的特异性较高。

实施方案4：用HCV临床血清样品进行E-LAMP检测方法的验证

对收集于甘肃省临床检验中心和湖北省干细胞研究中心的60份丙型肝炎病人的血清进行检测，E-LAMP检测HCV病毒的阳性检测结果与常规RT-PCR方法或Real time-PCR方法完全一致，说明检测的特异性和灵敏度是满意的。