双向转录/表达载体的构建及其在马流感病毒反向遗传系统中的应用

摘要

为构建用于拯救流感病毒的双向转录/表达载体,本研究以pEF4/myc-His B为骨架首次构建了含有人源的EF1-α和polI双启动子的载体pEZ,并通过报告基因证明其具有双向转录/表达的功能.此外,基于pEZ载体分别构建含有马流感病毒(EIV) A/equine/Jilin/1/1989 (H3N8) (JL89)株各个节段cDNA的8个重组质粒,且其中HA节段通过点突变技术引入分子遗传标记(Hind Ⅲ和Nde Ⅰ酶切位点).将8个重组质粒共转染293T细胞,拯救出病-毒(rJL89).病毒滴度测定显示,拯救的第一代病毒具有较高的病毒滴度(2.38×105 TCID50/mL);序列分析表明,rJL89与JL89的各个节段的序列几乎一致性(99.9％～100％);酶切鉴定表明,rJL89稳定携带分子遗传标记(Hind Ⅲ和Nde Ⅰ酶切位点);血凝效价测定表明,rJL89与JL89有相同的血凝效价(28);生长动力学研究显示,rJL89具有与JL89相同的生物学特性.以上结果证明,基于pEZ载体建立了EIV JL89株的8质粒反向遗传系统,该系统可以拯救出较高滴度的病毒.本研究将为进一步开展EIV分子生物学研究提供有效平台.