一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用

摘要

本发明公开了一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用。本发明的一种双向转录/表达质粒是以真核表达载体pEF4/myc‑His B为骨架进行改造得到的。为了建立马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的反向遗传操作系统，本发明使用构建得到的双向转录/表达质粒双向分别表达马流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因，通过共转染、测序、生长曲线的绘制和酶切鉴定，成功拯救得到一株EIV及其突变体。同时与现有的pBD系统进行产毒量的比较，表明本发明建立的反向遗传操作系统优于pBD系统。本发明的提出为流感病毒的反向遗传研究提供了一种新的技术手段，同时也为日后深入研究马流感病毒的传播，致病机理，乃至疫苗候选株的筛选奠定了坚实基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双向转录质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，根据NP蛋白和M蛋白的抗原性可分为，A、B和C型流感病毒。其中，C型流感病毒仅温和感染人，几乎无症状。A型和B型流感病毒均可导致季节性的流感，而A型流感病毒可以造成全球大流行。此外，流感病毒的基因组由7(C型)或8(A型和B型)个分节段的单链负义RNA组成，容易发生重排，产生新的毒株，这使流感的防控遇到了挑战。研究流感病毒对于促进流感病毒的认识和流感的防控具有积极意义。

反向遗传学为流感病毒研究中应用最为广泛的工具之一。目前，已经有许多病毒拯救系统被应用于流感病毒的相关研究中，其中以8质粒系统最为简便易行，其核心是双向转录/表达载体。这类载体一般拥有转录方向相对的polI启动子和polII启动子，能够以同一cDNA为模板分别转录病毒负链RNA和表达病毒蛋白，进而组装出病毒。2000年，Hoffman等首次利用pHW2000载体建立了H1N1的8质粒系统。2005年，李泽君等首次使用基于pBD载体的8质粒系统研究H5N1禽流感病毒。尽管pHW2000和pBD均采用强有力的CMV启动子，拯救的第一代病毒的滴度仍然较低，需要通过MDCK细胞或鸡胚扩大培养，费时费力，难以适应诸多研究需求。然而，有报道称EF1-α启动子比CMV启动子活性要高。或许可以采用EF1-α启动子构建双向转录/表达载体，建立8质粒反向遗传系统，拯救出更高滴度的病毒。

基于上述假设，经过科学实验验证，特提出本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种双向转录/表达载体，其特征在于以真核表达载体pEF4/myc-His B为骨架进行改造：在所述pEF4/myc-His B载体的KpnI和BclI酶切位点之间插入鼠源的polI终止子、BsmBI酶切位点和人源的polI启动子序列；在其SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的Linker序列，替换原载体上从f1ori到SV40poly A信号之间的非必需元件，所述的Linker序列为5’-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3’，将改造后的载体命名为pEZ。

在本发明中，优选的，所述的双向转录/表达载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种马流感病毒的反向遗传操作系统，其含有8个基于本发明所述的双向转录/表达质粒而构建的重组质粒，分别表达野生型或突变型的马流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因节段。

在本发明中，优选的，所述的流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因节段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-9所示。

在本发明的一个具体实施例中，优选的，HA基因节段带有HindIII和NdeI酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID>

更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的反向遗传操作系统在马流感病毒拯救中的用途。

一种利用本发明所述的反向遗传操作系统拯救马流感病毒的方法，包括以下步骤：

(1)双向转录/表达载体的构建

真核表达载体pEF4/myc-His B为骨架进行改造：在所述pEF4/myc-His B载体的KpnI和BclI酶切位点之间插入鼠源的polI终止子、BsmBI酶切位点和人源的polI启动子序列；在其SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的Linker序列，替换原载体上从f1ori到SV40poly A信号之间的非必需元件，所述的Linker序列为5’-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3’，将改造后的载体命名为pEZ；

(2)携带病毒cDNA的重组质粒的构建和分子标记的引入

提取A/equine/Jilin/1/1989株的病毒RNA，以uni12为反转录引物，以各个节段相应引物对为扩增引物，使用RT-PCR方法扩增8个基因节段：PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M和NS；各个节段经BsmBI或BsaI酶切后，分别定向克隆到pEZ的BsmBI之中，构建得到8个重组质粒；

所述的引物序列如下所示：

(3)重组病毒的拯救

使用步骤(2)构建得到的8个节段的重组质粒共转染细胞，拯救重组病毒。

在本发明所述的方法中，优选的，还包括使用以下引物对对野生型HA节段进行T⁴⁴⁹C和C⁹⁸³T的无义点突变，构建含有突变型HA节段的重组质粒，使其HA节段含有单一的HindIII和NdeI酶切位点，使用含有突变的HA节段的重组质粒和分别含有另外7个节段的重组质粒共转染细胞，拯救重组病毒；

5’-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-3’

5’-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-3’和

5’-CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3’

5’-GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3’

更优选的，突变的HA节段的核苷酸序列如SEQ ID>

在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)构建得到的双向转录/表达载体pEZ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明所述的方法中，优选的，流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因节段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-9所示。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明采用了人源的EF1-α和polI启动子创造出了优化的双向转录/表达载体，EF1-α启动子和BGH poly A信号位于polI启动子和终止子外侧且两个启动子的转录方向相对，并在polI启动子和终止子之间含有两个BsmBI酶切位点以便于插入外源DNA片段，具有利用同一模板转录出mRNA和负链RNA的功能，可以应用于负链RNA病毒的研究中，建立反向遗传系统。本发明将其运用于EIV JL89株及其变异体的反向遗传学中，成功拯救了EIV JL89。并且此系统与国内现有的pBD系统相比，该系统可以大量拯救第一代病毒，其滴度是pBD系统的19倍，显著高于pBD系统，产毒量更高。

附图说明

图1为双向转录/表达载体pEZ的构建示意图；

图2为pEZ-vEGFP的构建示意图；

图3为绿色荧光的检测结果；

图4为负链RNA完整性检测结果；

图5为扩增的8个片段的电泳检测结果；

图6为HA节段的酶切鉴定结果；

图7为在MDCK细胞中的生长动力学曲线；

图8为采用pEZ系统以及pBD系统拯救病毒滴度的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明以下实施例中所涉及的主要试剂和实验材料

1、病毒株和细胞

A/equine/Jilin/1/1989(H3N8)病毒株(简称JL89)已记载在文献(黑龙江省一株马流感病毒的全基因组测序及同源性分析，赵钊等，《中国动物检疫》，2015年12期)，现由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存、提供；HEK293T细胞和MDCK细胞由本实验室保存。

2、主要试剂

pEF4/myc-His B质粒、SuperScript III反转录酶、RNA酶抑制剂、Lipofectamine 2000转染试剂购自invitrogen公司；T4RNA连接酶、Phusion DNA聚合酶、限制性内切核酸酶购自New England Biolabs公司；病毒RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；pMD18-T载体购自TaKaRa公司；pBD载体由陈化兰研究员惠赠；SPF鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

实施例1 双向转录/表达载体的构建及功能鉴定

1、双向转录/表达载体的构建

如图1所示，以真核表达载体pEF4/myc-His B为骨架进行改造：在其KpnI和BclI酶切位点之间插入必需元件(Insert 1，序列如SEQ ID NO.11所示)——鼠源的polI终止子(TpolI，33bp)、BsmBI酶切位点和人源的polI启动子(PpolI，236bp)序列；在其SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的Linker序列(Insert2，序列为5’-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3’)，替换原载体上从f1ori到SV40poly A信号之间的非必需元件。改造后的载体命名为pEZ，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、携带报告基因的重组质粒构建

在pEZ载体中插入报告基因以验证其双向转录/表达功能。使用引物对(5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGATATTTAAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(BsmBI)/5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’(BsmBI))，以EGFP基因为模板，利用PCR方法获得报告基因(vEGFP，765bp)，其5’末端和3’末端分别融合上EIV>

3、绿色荧光的检测

按照Lipofectamin 2000说明书，将重组质粒pEZ-vEGFP转染丰度达90％以上的293T细胞，6h后换液，48h后置于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。实验中同时设置空载体对照。

4、负链RNA完整性的检测

质粒转染48h后使用TRIzol提取细胞中的总RNA。以uni12(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)为反转录引物，以引物对M-F/M-R(表1)为扩增引物，通过RT-PCR方法扩增vEGFP，克隆于pMD18-T载体并测序验证。

同时，利用RNA连接技术使RNA分子环化，以O-vEGFP F(5’-CTGCTGCCCGACAACCACTACCTGA-3’)为反转录引物，以引物对O-vEGFP F/O-vEGFP R(5’-GTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTC-3’)为扩增引物，通过RT-PCR方法扩增vEGFP的非编码区，克隆于pMD18-T载体并测序验证。

结果：

双向转录/表达载体pEZ改造自真核表达载体pEF4/myc-His B，在其polI启动子和polI终止子序列之间含有两个BsmBI酶切位点以便于定向克隆外源DNA片段，其EF1-α启动子和BGH poly A信号位于polI启动子和polI终止子外侧且两个启动子的转录方向相对(图1)。其中EF1-α启动子和BGH poly A信号可以指导mRNA的转录，进而翻译出蛋白；而polI启动子和polI终止子能够控制负链RNA的转录。

为了验证pEZ载体具有利用同一模板转录出mRNA和负链RNA的功能，构建重组质粒pEZ-vEGFP，其vEGFP由5’UTR，EGFP和3’UTR组成(图2)。pEZ-vEGFP和pEZ分别转染293T细胞，48h后观察绿色荧光。pEZ-vEGFP转染的细胞可以观察到绿色荧光，而pEZ转染的细胞没有绿色荧光(图3)。这表明pEZ-vEGFP在细胞内以vEGFP为模板转录出相应的mRNA，进而翻译出EGFP蛋白。

一方面，质粒转染后提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增(RT组)和直接PCR扩增(No RT组)。其中，仅pEZ-vEGFP转染后可以经RT-PCR扩增出与阳性对照(+Ctrl)相符的条带，而其他处理不能扩增出相应条带(图4A)，并且测序结果与vEGFP序列一致。另一方面，提取的RNA分子经RNA连接酶作用后进行RT-PCR扩增。其中pEZ-vEGFP转染后能够扩增出与预期(212bp)相符的条带，而pEZ转染后不能扩增出相应条带(图4B)。此外测序结果与预期一致(图 4C)。这表明pEZ-vEGFP在细胞内以vEGFP为模板转录出完整的具有精确的5’UTR和3’UTR的负链RNA。

以上结果表明pEZ载体具有双向转录/表达功能，可以利用同一模板表达出相应的蛋白和转录出完整的负链RNA。

实施例2EIV反向遗传系统的建立

1、携带病毒cDNA的重组质粒的构建和分子标记的引入

按病毒RNA提取试剂盒使用说明书提取EIV JL89株的病毒RNA，以uni12为反转录引物，以各个节段相应引物对(表1)为扩增引物，使用RT-PCR方法扩增8个基因节段(PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M和NS)。各个节段经相应的限制性内切酶(BsmBI或BsaI)酶切后，分别定向克隆到pEZ的BsmBI之中，构建得到8个重组质粒，所含有的8个基因节段—PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因节段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-9所示。

表1 扩增8个节段的引物

此外，使用引物对5’-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-3’/5’-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-3’和5’-CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3’/5’-GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3’，对野生型(wt)HA节段进行无义点突变(T⁴⁴⁹C和C⁹⁸³T)，构建含有突变型(mutant)HA节段的重组质粒，使其HA节段含有单一的HindIII和NdeI酶切位点，突变后的HA节段的核苷酸序列如SEQID>

结果：

提取病毒RNA，经RT-PCR扩增8个节段(图5)，将其分别克隆至pEZ载体的BsmBI之中，构建8个重组质粒。

2、重组病毒的拯救

使用含有突变的HA节段的重组质粒和分别含有另外7个节段的重组质粒共转染细胞，拯救重组病毒。按照Lipofectamin 2000说明书，将8个重组质粒各0.5μg(共4μg)和10μL脂质体分别溶于250μL Opti-MEM中，二者混匀，逐滴加入到六孔板中丰度达90％以上的293T细胞中，转染6h后换液为无抗无血清的Opti-MEM，转染30h后加入终浓度为250ng/mL的TPCK-胰酶，转染48h后收获上清，将其作为第一代重组病毒(rJL89)。使用9～11日龄SPF鸡胚扩大培养rJL89，72h后收获尿囊液，使用1％鸡红细胞测定其血凝效价。

结果：

利用定点突变技术构建HA节段上含有HindIII和NdeI酶切位点的重组质粒。将该质粒与另外7个质粒共转染293T细胞拯救重组病毒，在鸡胚中复制后HA效价达到2⁸。这说明拯救出重组病毒(rJL89)。

实施例3重组病毒的鉴定

1、重组病毒的序列测定和其分子标记的检测

按照实施例2方法1中所述引物和方法扩增rJL89的8个节段，克隆至pMD18T载体，测定各个节段序列，并与JL89各个节段序列进行比对分析。同时，使用限制性内切酶HindIII和NdeI对HA节段进行酶切鉴定。

结果：

克隆rJL89的8个节段，并测定其序列。rJL89的各个节段与JL89的比对显示，HA节段含有无义突变(T⁴⁴⁹C和C⁹⁸³T)，与JL89的HA节段一致性达 99.9％；而PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS与JL89的相应节段一致性达100％；这说明rJL89的遗传信息几乎全部源自JL89。

rJL89的HA节段含有HindIII和NdeI酶切位点，以此为分子标记区分拯救的重组病毒株和亲本毒株。利用限制性内切酶HindIII和NdeI酶切该突变型(mutant)HA节段和野生型(wt)HA节段。结果显示，突变型(mutant)HA可以被HindIII切割为两条带(约446bp和1 319bp)，被NdeI切割为两条带(约785bp和980bp)，被HindIII和NdeI双酶切为三条带(约446bp、534bp和785bp)；而野生型(wt)HA不能被切割，与阴性对照(-Ctrl)带型相符(图6)。这说明重组病毒rJL89已经稳定携带该分子标记。

2、病毒生长动力学测定

以0.01moi的病毒量感染MDCK细胞，分别于感染后3、6、9、12、24、36、48、60和72h收获上清液。使用TCID₅₀法测定各个时间点的病毒滴度，将病毒液进行倍比稀释(10^-1～10^-11，共11个稀释度)，各个稀释度100μL接种8孔MDCK细胞，72h后统计各个稀释度下出现细胞病变的孔数，计算病毒滴度(TCID₅₀/mL)。以感染时间(Hours>50/mL)为纵坐标，绘制病毒生长曲线。并利用统计学方法分析各个时间点rJL89和JL89病毒滴度的差异。

结果：

rJL89经鸡胚扩大培养后，其血凝效价达到2⁸，与JL89的血凝效价相同。这表明rJL89保存了JL89的血凝特性。

rJL89和JL89感染MDCK细胞后不同时间点收获上清，并测定其病毒滴度，绘制生长曲线(图7)。从图7结果可以看出：rJL89感染MDCK细胞后，在0～12h内其病毒滴度缓慢增长；在12～48h内其病毒滴度迅速上升并达到峰值；之后维持在此滴度附近。这与JL89的生长特性相同。尽管二者在各个时间点的病毒滴度有差别，但差异不显著。这表明该系统成功拯救出具有感染性的病毒粒子，且在MDCK细胞上rJL89具有与JL89相同的生长特性。

实施例4pEZ系统拯救病毒能力的评估

方法：

利用pEZ系统和pBD系统(由本实验室构建，亦含有JL89的全基因组，参考文献：Li Z,Chen H,Jiao P,Deng G,Tian G,Li Y,Hoffmann E,Webster RG,Matsuoka Y,Yu K.Molecular basis of replication of duck H5N1influenza viruses in a mammalianmouse model.J Virol.2005Sep；79(18):12058-64.PubMed PMID:16140781；PubMedCentral PMCID:PMC1212590.)，使用实施例2方法2中所述方法拯救病毒。使用实施例3方法2所述方法测定第一代病毒的滴度。利用统计学方法分析二者差异。

结果：

使用pEZ系统和pBD系统同时拯救病毒，并测定第一代病毒的滴度。结果分别为2.38×10⁵和1.25×10⁴个TCID₅₀/mL，说明pEZ系统拯救病毒的滴度是pBD系统的19倍，二者差异显著(图8)。