PDE4抑制剂罗氟普兰通过促进自噬抑制小胶质细胞活化作用机制

摘要

目的神经炎症参与神经退行性疾病的发展进程,而小胶质细胞活化是神经炎症的特征之一。罗氟普兰(ROF)是一种新型致呕吐潜能低的磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂。我们之前发现,ROF可能通过促进自噬从而抑制活化的小胶质细胞中促炎因子的产生,但其机制尚不明确。本研究旨在探究ROF促进自噬抑制小胶质细胞活化作用及机制。方法使用Aβ25-35诱导BV-2细胞活化,采用ELISA试剂盒检测白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;建立神经炎症细胞及炎症小体活化细胞模型,模型条件下用自噬激活剂雷帕霉素诱导自噬,用自噬特异性抑制剂3-MA等抑制自噬及转染PDE4质粒,实现敲低PDE4基因;使用AMPK抑制剂和ULK1抑制剂评价是否阻断药物作用,上述情况下检测自噬相关信号通路中关键蛋白及激酶的变化。在C57小鼠侧脑室定位注射Aβ25-35构建小鼠炎症模型,通过新物体识别等行为学实验方法观察模型小鼠学习记忆能力的损伤及PDE4抑制剂能否改善学习记忆的能力。取脑组织,采用免疫荧光双标法检测海马和皮质中小胶质细胞自噬相关蛋白的表达。用ELISA和Western印迹法分别检测小胶质细胞炎症因子的水平及M1和M2表型标志物的水平。结果①Aβ25-35处理BV-2小胶质细胞显著增加细胞的活化水平,ROF可以有效减轻Aβ25-35诱导的小胶质细胞活化,并降低Iba1的表达水平;同时,给予ROF或者敲低PDE4B能显著降低模型条件下炎症因子的水平。②Aβ25-35处理BV-2小胶质细胞后自噬水平下降,给予ROF,显著上升;在给予ULK1抑制剂后,ROF的促自噬作用则被阻断。③小鼠侧脑室注射凝聚态的Aβ25-35,明显影响小鼠的学习记忆能力;ig给予ROF改善其学习记忆能力,海马和皮质中小胶质细胞活化水平也明显下降,促炎因子降低,其自噬蛋白水平升高;ig给予ROF和ULK1抑制剂组逆转这些现象。结论PDE4抑制剂ROF可能通过AMPK/ULK1信号转导通路促进自噬,从而抑制Aβ25-35诱导BV-2小胶质细胞炎症因子,减轻海马和皮质中小胶质活化,也可能依赖ULK1蛋白,从而产生神经保护作用。