基于STAT3/NLRP3双信号通路协同调节髓源抑制性细胞探讨双参抑制肿瘤转移机制

摘要

目的 在肿瘤转移过程中,转移前微环境(PMN)的形成,对于形成肿瘤远端转移灶至关重要.PMN是以免疫抑制为特征,其中免疫负性调控细胞——髓源抑制性细胞(MDSC)发挥重要作用.MDSC可以诱导PMN形成并促进循环肿瘤细胞向PMN迁移,最终导致转移灶形成.基于课题组前期研究表明,丹参作为活血化瘀之要药,其中多种化合物具有改善微循环,提高免疫功能,抗肿瘤作用.人参可通过调节机体免疫微环境,进而发挥抗肿瘤作用.然而,丹参与人参联用(双参)是否能够达到协同抗肿瘤转移的作用,尚未可知.本研究以益气活血中医治则为理论基础,探讨双参是否能够协同作用于MDSC,抑制PMN形成,将有助于达到"已病防变"的治疗目的.方法 ①体外培养B16F10黑色素瘤细胞,分别设置双参不同剂量组,进行细胞划痕实验、Transwell实验及3D侵袭实验,观察丹参、人参不同剂量配比对B16F10迁移及侵袭能力的影响,其结果利用多药联用效应计算软件SynergyFinder进行协同评分.②通过动物实验探究双参是否能够通过调节免疫微环境有效抑制B16F10肺转移.建立B16F10-luci尾静脉血行转移模型,设置空白对照组、模型组、顺铂组、双参低中高剂量组,连续给药3周后,分别通过小动物活体成像、HE病理染色等技术评价双参对B16F10肺转移的影响.通过流式细胞术及免疫组化分别考察药物对小鼠体内CD4、CD8+T和MDSCs的表达的影响.③探究丹参和人参是否分别通过IL-6/STAT3及NLRP3/胱天蛋白酶1/IL-1β双信号通路影响MDSC在肺部转移灶的募集,进而抑制PMN形成,有效抑制肿瘤转移.分别通过Western印迹法、q-PCR、免疫组化及免疫荧光等方法对上述生物过程和信号通路进行分析.结果 ①根据B16F10体外迁移侵袭实验的结果,确定丹参-人参(2:1)联合给药具有协同效应,且协同作用最强.②动物实验结果表明,双参能有效抑制B16F10肺转移,且能够提高小鼠外周血及脾中CD4、CD8+T细胞的表达,减少MDSC的表达.肺组织免疫组化结果显示,双参能够增加肺部转移灶中CD4和CD8+T细胞的浸润,增强荷瘤小鼠免疫功能.③Western印迹法、q-PCR、免疫组化及免疫荧光等实验结果显示,丹参能够抑制IL-6和STAT3在肺部转移灶的表达.人参可以有效抑制NLRP3、胱天蛋白酶1和IL-1β在肺部转移灶的表达.免疫荧光双染结果显示,STAT3及NLRP3与Gr-1存在荧光共定位现象,表明丹参及人参可以分别通过IL-6/STAT3及NLRP3/胱天蛋白酶1/IL-1β双信号通路协同影响MDSC.结论 从细胞层面验证了丹参及人参联合用药可协同抑制B16F10黑色素瘤细胞迁移、侵袭;从动物层面验证了丹参及人参联合用药相较于单给药,更能有效抑制B16F10肺转移;从机制方面发现丹参及人参可以分别作用于IL-6/STAT3及NLRP3/胱天蛋白酶1/IL-1β,协同抑制MDSC在肺部转移灶的聚集,最终破坏PMN的形成,达到有效抑制黑色素瘤转移的作用.