DAPK1基因开放读码序列的克隆、序列分析及诱导Raji细胞凋亡

摘要

目的:探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK1)在肿瘤的形成、转移中所起作用,克隆DAPK1基因的开放读码序列(ORF).方法:根据GenBank提供的核苷酸序列,自行设计引物,用RT-PCR从K562细胞中扩增DAPK1基因的ORF;用质脂体将pcDNA3.1(+)-DAPK1转染到Raji细胞,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,MTT法观察DAPK1基因对细胞生存的影响.结果:DAPK1基因的ORF克隆到质粒pMD18-T,测序鉴定;分析结果显示,从K562细胞成功扩增 4 300 bp的DAPK1基因ORF有7处突变,其中6处是同义突变,1处是基因的单链核苷酸多态性;DAPK1基因的ORF克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化到Raji细胞;转染48 h后,可以检测到DAPK1的表达,并可以观察到细胞发生凋亡.结论:大片段的基因可以采用RT-PCR法直接克隆,采用常规的转染技术可以将大片段基因转染到宿主细胞;成功克隆具有活性功能DAPK1基因ORF,过表达的DAPK1基因可以诱导Raji细胞凋亡.