线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

摘要

目的:通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础. 方法: 根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,插入到pENTR/U6质粒缺口末端,连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体;通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest 载体上,构建含U6启动子、靶序列和Pol Ⅲ终止子表达框的MTCOX-I shRNA表达重组体;经脂质体导入293FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度.Western blotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达. 结果: 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒.Western blotting检测结果证实构建的MTCOX-I shRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达. 结论: 成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体.