腺病毒介导反义c-myc联合咖啡因在骨肉瘤化疗中增效作用的实验研究

摘要

目的:构建重组反义c-myc腺病毒并探讨其与咖啡因对人骨肉瘤MG-63细胞顺铂化疗的影响.方法:应用基因重组技术,将约750 bp的人c-myc cDNA反向克隆到腺病毒载体,构建表达反义c-myc的重组腺病毒(Ad-Asc-myc),与咖啡因、顺铂单独或联合体外作用于人骨肉瘤MG-63细胞,采用蛋白免疫印迹(Western blotting)、MTT、流式细胞仪(FCM)、透射电镜等检测c-Myc蛋白、bcl-2、bax、E2F-1等基因表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析Ad-Asc-Myc、咖啡因对人骨肉瘤MG-63细胞顺铂化疗的影响.结果:成功构建Ad-Asc-myc,滴度可达2×1012pfu/L,体外转染MG-63细胞48 h后,可降低c-Myc蛋白表达,并抑制其体外增殖;Ad-Asc-myc、2.0 mol/L咖啡因分别与浓度为2.0、5.0 mg/L顺铂共同作用后,可增加顺铂对MG-63细胞的体外增殖抑制率;Ad-Asc-myc联合2.0 mol/L咖啡因能明显加强顺铂的体外抗肿瘤作用,凋亡相关基因bcl-2基因表达下降,bax表达上升,而E2F-1表达无明显变化;FCM检测显示Ad-Asc-myc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,并增加顺铂诱导瘤细胞凋亡作用;单独咖啡因不能诱导瘤细胞凋亡,但能增加顺铂诱导瘤细胞凋亡作用;Ad-Asc-myc联合2.0 mol/L咖啡因能明显加强顺铂诱导瘤细胞凋亡作用.细胞周期分析显示顺铂作用后瘤细胞出现S期阻滞,而咖啡因则能逆转这种阻滞;Ad-Asc-myc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞.结论:腺病毒介导反义c-myc联合咖啡因能明显增强顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞的诱导凋亡及化疗作用.