人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

摘要

目的:构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达.方法:从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物,并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV.将经pme Ⅰ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a.将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞(HEK293)中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒.将重组腺病毒感染hMSCs,利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达.结果:限制性内切酶分析和DNA测序结果显示,重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确.在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a.rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强.结论:成功构建了人miR-133a重组腺病毒,并在hMSCs中高效表达出miR-133a,为进行miR-133a的功能研究创造条件.