重组人fgl2微小RNA腺病毒表达载体的构建及其体外干预效应和体内分布的初探

摘要

【目的】
　　前期研究表明,人纤维介素(human fibrinogen like protein 2 prothrombinase,fgl2)是肿瘤生长和转移等的关键因素,本研究针对这一基因,构建重组hfgl2的微小RNA(miRNA)腺病毒(Adenovirus,Ad)表达质粒(pAd-hfgl2-miRNA),并进行包装、扩增为重组hfgl2-miRNA腺病毒(Ad-hfgl2-miRNA)。研究重组Ad-hfgl2-miRNA在细胞水平对hfgl2基因表达的抑制作用,及其在裸小鼠皮下移植瘤肝癌模型中体内hfgl2表达的分布情况。
　　【方法】
　　1.利用miRNA设计软件,针对hfgl2基因分别设计3对pre-miRNA序列,构建表达质粒,pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1、2、3和非相关干扰质粒,然后将其分别与pcDNA3.1-hfgl2共转染至人胚肾细胞(293T细胞),通过Real-timePCR和western-blot检测在细胞水平的干预效应。
　　2.参照Invitrogen公司的腺病毒表达系统试剂盒说明书,使用GATEWAY技术将pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1表达质粒重组成pAd-hfgl2-miRNA腺病毒表达质粒。然后进行病毒包装、扩增,制备重组hfg12-miRNA腺病毒颗粒。
　　3.使用病毒DNA小提试剂盒,PCR扩增片段,鉴定目的基因。
　　4.使用TCID50法测定重组Ad-hfgl2-miRNA的滴度。
　　5.确定腺病毒感染HCCLM6细胞的最适感染复数MOI,并共培养,使用RealtimePCR和Western-Blot检测其抑制作用,使用PKH26法以流式细胞技术检测hfgl2干扰后的HCCLM6细胞增殖能力的改变;使用CCK-8法测定半数抑制浓度。
　　6.瘤内注射1×109IU带有绿色荧光蛋白的重组Ad-hfgl2-miRNA,使用活体荧光成像仪连续拍照,直至荧光消失。
　　7.使用RealtimePCR检测瘤内注射1×109IU重组Ad-hfgl2-miRNA后第1、3、7、9、11、15、19、24天,裸小鼠人肝癌模型的心、肝、脾、肺、肾、小肠及荷瘤的hfgl2-miRNA表达情况。
　　8.采集瘤内注射1×109IU重组Ad-irrelevant-miRNA后第1、3、7、11、24天裸小鼠人肝癌模型的眼球血,采集有荷瘤但未进行任何干预的裸小鼠的眼球血及无荷瘤的正常裸小鼠的眼球血,一并行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH-L)、尿素氮(BUN)、血肌酐(CR)检测。重组Ad-irrelevant-miRNA干预裸小鼠的心、肝组织用4％的甲醛固定,行H.E.染色,观察组织病理学改变。
　　【结果】
　　1.成功构建重组人fg12微小RNA腺病毒表达载体,合成、扩增重组人fg12微小RNA腺病毒。
　　2.在细胞水平水平,重组Ad-hfgl2-miRNA对hfgl2表达具有明显抑制作用,IC50=600MOI。
　　3.活体荧光成像仪可观察到注射后第1天即有荧光表达,以第3、4天表达最强,第7、8天消失。
　　4.QRT-realtimePCR可在裸小鼠心、肝、脾、肺、肾、小肠及给药部位荷瘤检测到hfgl2-miRNA,并维持停药后第24天。心、脾、肺、肾、荷瘤组织中的mRNA表达水平,以给药后第7天为表达高峰,组间无明显差异,P>0.05。在肝脏中的mRNA水平,第3天为表达高峰,较空白对照组、其他时间点明显增高,具有显著性差异P<0.05。在小肠中的mRNA水平,第7天为表达高峰,较空白对照组、其他时间点明显增高,具有显著性差异P<0.01。第11天表达水平较空白对照组明显增高,两者比较具有统计学意义P<0.05,其他时间点与空白对照组无明显差异。
　　5.血生化检测:Ad-irrelevant-miRNA注射后,第1、3、7、11、24天,ALT、AST、CK、LDH-L可观察到增高趋势,但无统计学异常,P>0.05。BUN、CR基本正常。非相关对照组、空白有荷瘤对照组与空白无荷瘤对照组之间无显著性差异,P>0.05。心、肝组织HE染色,显微镜下未见实质细胞明显损伤性改变(如:细胞大量坏死,明显出血和炎症细胞浸润等)。
　　【结论】
　　1.重组人fg12微小RNA腺病毒表达载体的成功构建,为研究miRNA对基因治疗提供应用基础。
　　2.重组人fgl2微小RNA腺病毒注射液在体外可有效抑制hfgl2的表达及增殖作用,为肝癌模型体内实验提供实验基础。
　　3.hfgl2在模型中广泛分布,重组人fgl2微小RNA腺病毒注射液在体内无明显毒性作用,为针对hfgl2这一关键靶基因的肝癌治疗的安全性研究提供了基础。

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英文缩略语对照表

中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分 重组人fg12微小RNA腺病毒的构建、包装、鉴定及扩增

1B材料与方法

结 果

讨 论

第二部分 重组人fg12微小RNA腺病毒在细胞水平的抑制作用

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分 重组人fg12微小RNA腺病毒在裸鼠人肝癌模型中体内分布的初探

材料与方法

结 果

讨 论

综 述

参考文献

致谢