siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

摘要

目的:构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子(MIF)特异性siRNA重组逆转录病毒载体,将其导入PHOENIX细胞中,筛选出分泌MIF-siRNA病毒的包装细胞,其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达,并初步了解稳定沉默MIF细胞株的特性.方法:体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体,构建的载体通过酶切、测序鉴定后,采用脂质体介导转染包装病毒细胞株PHOENIX.收获病毒上清;将其感染HeLa细胞株,经过嘌呤霉素筛选得到抑制MIF表达的HeLa细胞株.Western blotting鉴定MIF表达的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa-pSuper-MIF和HeLa-pSuper-mock之间的特性.结果:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF,转染包装病毒细胞株PHOENIX,病毒上清感染HeLa细胞,抑制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达.沉默MIF蛋白后导致HeLa细胞迁移能力下降,不依赖支持物生长的特性减弱和黏附能力下降,同时稳定表达沉默MIF蛋白的细胞株生长周期停留在G0/G1期与对照组相比凋亡减少.结论:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF,转染包装细胞所产生的病毒上清,能够抑制HeLa细胞内的MIF蛋白表达,表明MIF对HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用.