人胰岛新生相关蛋白基因毕赤酵母表达载体的构建

摘要

目的构建分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白（rhINGAP）载体毕赤酵母。方法通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K,SalⅠ酶切线性化重组质粒αINGAP/pPIC9K。电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,Western blotting鉴定目的蛋白,ELISA法定量测定其含量。结果重组表达质粒αINGAP/pPIC9K经酶切获得758bp片段,符合α因子与INGAP片段融合的长度,筛选得到3个阳性转化子,培养上清含有与抗INGAP抗体反应的蛋白。结论成功构建了分泌INGAP蛋白的毕赤酵母菌株。