缺氧下软骨细胞失分化过程中胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶的作用研究

摘要

目的 观察缺氧对软骨细胞体外培养时的失分化过程的影响,探讨胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶(collagen prolyl 4-hydroxylases,C-P4Hs)在其中的作用.方法 对软骨细胞进行不同浓度的COCl2处理,筛选用于缺氧诱导的最佳CO-Cl2浓度为100μmol/L后,将小鼠肋软骨细胞分为:常氧组、缺氧组,分别检测第3代0.5-72h及1、3、5、7代于72h的各项指标.使用CCK8法及细胞计数测定增殖率,RT-qPCR、免疫荧光染色、Western blot检测各组HIF-1α、P4Hα1、P4Hα2和Col-Ⅱ的动态变化.结果 肋软骨细胞在不同浓度COCl2条件下培养48 h,100 μmol/L的COCl2组增殖率最高,呈典型的铺路石状;当COCl2浓度＞150 μmol/L时,增殖率(P＜0.05)降低.常氧与缺氧下诱导肋软骨细胞0-72h,RT-qPCR显示缺氧组P4Hα2、ColⅡmRNA表达升高(P＞0.05).免疫荧光显示缺氧下HIF-1α与P4Hα2累积于胞核内,P4Hα2逐渐由胞核进入胞浆中.Western-blot显示缺氧组HIF-1α、P4Hα2蛋白表达(P＜0.05)增高.缺氧组ColⅡ蛋白表达(P＜0.05)在诱导后期增高.常氧与缺氧下培养肋软骨细胞1-7代,CCK8与细胞计数结果显示缺氧组各代细胞增值率及细胞数均增高(P＜0.05),且传至6-7代时仍有增殖的潜力.RT-qPCR显示缺氧组各代细胞中P4Hα2、ColⅡ的mRNA均增高(P＜0.05).Western-blot显示,缺氧组各代HIF-1α、P4Hα2、ColⅡ蛋白表达(P＜0.05)均增高.结论 通过缺氧诱导高表达HIF-1α,从而使P4Hα2表达增高,可加速ColⅡ在软骨细胞内翻译后修饰过程,增加ColⅡ的合成和累积.缺氧条件下体外培养软骨细胞增殖率增高、失分化过程延缓可能与P4Hα2有关.