人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性

摘要

目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）58型:E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性。方法分别定点突变HPV58型E6和E7基因中3个氨基酸的密码子,去除突变后的E6和E7基因的终止码并将其基因片段融合,突变修饰后的基因命名为HPV58 mE6E7。将重组质粒转染NIH/3T3细胞,pIRES-neo-HPV58 mE6E7转染组为实验组,pIRES-neo-HPV58 E6E7转染组为阳性对照组,pIRESneo空载转染组为阴性对照组。流式细胞术、免疫荧光和Western blot检测转染细胞HPV58 mE6E7融合蛋白的表达,软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测HPV58 mFE/6E7融合蛋白的转化活性。以HPV58 mE6E7融合基因为靶抗原构建DNA疫苗,免疫小鼠后采用酶联免疫吸附试验检测免疫鼠血清中特异性抗体,酶联免疫斑点法检测免疫鼠脾淋巴细胞中可分泌γ干扰素的特异性CD8+T细胞数。结果将pGEM-T easy/HPV58 mE6E7和pMD-18T/HPV58 E6E7质粒分别测序,HPV58 E6E7融合基因与HPV58型E6和E7基因标准序列的同源性达100%,并证实点突变成功。稳定转染HPV58mE6E7和HPV58 E6E7的NIH/3T3细胞表达率分别为70.3%和84.1%。实验组和阳性对照组HPV58 mE6E7和HPV58 E6E7融合蛋白的相对表达水平分别为2.1±1.7和3.8±1.4,阴性对照组HPV58 mE6E7和HPV58 E6E7融合蛋白呈阴性表达。实验组和阴性对照组未见集落形成;阳性对照组有31个集落形成,其中＞50个细胞的集落10个。实验组和阴性对照组细胞接种裸鼠后,在4周内均未成瘤;而阳性对照组中有6只裸鼠形成肿瘤。以HPV58 mE6E7融合基因为靶抗原的DNA疫苗具有良好的抗原性,抗体滴度为25 600,特异性免疫斑点数为（218.8±34.4）个,明显高于对照组。结论修饰后的HPV58 E6E7基因可融合表达,并在消除其转化活性的同时保留其抗原性,可作为HPV58阳性相关肿瘤治疗性DNA疫苗的靶基因。