转化生长因子-β受体抑制剂复合物C促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向诱导

摘要

目的 观察转化生长因子-β(TGF-β)受体抑制剂复合物C对人胚胎干细胞(hESC)向视网膜色素上皮(RPE)细胞定向诱导效率的影响.方法 将H1 hESC分为对照组和实验组.对照组在细胞过度融合后,以去除碱性成纤维细胞生长因子的血清替代物培养体系诱导RPE细胞定向分化.实验组于诱导分化前6d在培养体系中加入1μmol/L复合物C.诱导分化第1、3、5周,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组人类配对盒基因(PAX6)、小眼球相关转录因子(MITF)、细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)、RPE65 mRNA的表达.将hESC来源的RPE(hESC-RPE)细胞分离纯化,采用RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot)和细胞免疫荧光法对纯化的hESC-RPE细胞进行鉴定.结果 诱导分化第4周,实验组肉眼可见色素团块,对照组无色素团块出现.将实验组的色素细胞分离纯化后,可见l00％的细胞表现为多角形色素化.RT-PCR检测结果显示,实验组PAX6 mRNA表达在诱导分化第1、3周显著高于对照组,差异有统计学意义(t=28.498、3.141,P＜0.05)；诱导分化第3、5周,实验组MITF(t=8.866、10.111)、CRALBP(t=5.293、5.394)和RPE65(t=9.263、9.504)的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).hESC-RPE细胞PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA表达均显著高于hESC(t=9.154、17.284、18.204、44.194)和ARPE-19(t=7.605、16.770、18.190、44.190)细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测结果显示,hESC-RPE细胞高水平表达RPE标志蛋白PAX6、RPE65.荧光显微镜观察发现,hESC-RPE细胞表达RPE细胞特异性标志蛋白PAX6、紧密连接蛋白-1.结论 TGF-β受体抑制剂复合物C能显著提高hESC向RPE定向诱导效率.