姜黄素对人胚胎干细胞向视网膜色素上皮样细胞定向诱导效率的促进作用

摘要

背景 来源于多能干细胞的视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）和视网膜色素变性（RP）是近年研究热点,但RPE体外分化诱导效率低下、成本高等一直是难以克服的障碍.研究表明,姜黄素（curcumin）可促进人胚胎干细胞（ESCs）的定向诱导分化,但其对人ESCs向RPE样细胞的定向分化的作用机制尚不清楚. 目的 研究体外培养的人ESCs向视网膜色素上皮（RPE）样细胞的诱导分化过程,探讨curcumin对人ESCs向RPE细胞定向诱导效率的影响及其机制. 方法 将人ESCs株进行体外培养,将处于对数生长期的ESCs传代至基质膜（Matrigel）包被的6孔板中,以mTeSRTM1培养基培养至过渡融合状态后更换为含质量分数87％ KnockOutTM DMEM、质量分数10％血清替代物（SR）、质量分数1％非必需氨基酸和质量分数1％谷氨酰胺及青链霉素双抗的分化诱导体系,同时加入终浓度为1 μmol/L的curcumin处理24 h,对照组培养基中未加入curcumin.分别于诱导培养3周及5周时提取细胞RNA及蛋白,采用荧光定量逆转录PCR（RT-PCR）法检测诱导RPE（iRPE）细胞中干细胞标志物、RPE相关标志物及Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA的相对表达水平;采用Western blot法及免疫荧光染色检测人ESCs、iRPE细胞及人RPE细胞中相关标志物蛋白的表达水平;通过细胞吞噬实验检测iRPE细胞的吞噬功能. 结果 Curcumin组诱导后3周时即可见iRPE细胞色素化,随着时间延长色素化程度更高,而对照组细胞在诱导后5周时开始出现细胞色素化.RT-PCR结果显示,curcumin诱导后3周及5周,curcumin组iRPE细胞中ESCs标志物NANOG mRNA的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=13.086,P=0.022;t=34.186,P=0.004）,而RPE标志物Pax6、RX、CRALBP及RPE65 mRNA的相对表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.Western blot检测显示,CRALBP、RPE65和MITF蛋白在iRPE细胞中表达,表达强度与人RPE细胞相近,而人ESCs不表达上述蛋白.免疫荧光染色显示,iRPE细胞中Pax6、MITF和ZO-1蛋白表达阳性,分别定位于细胞质和细胞膜,可见curcumin组得到的细胞为iRPE细胞,纯化效率达到100％,体外细胞吞噬实验显示,iRPE细胞的细胞质内呈现的聚苯乙烯荧光微球接近阳性对照组,而阴性对照组iRPE细胞中未见到聚苯乙烯荧光微球.诱导培养后第3周和第5周时,curcumin组细胞中Wnt信号通路下游靶因子Lef1、MYC和TCF7,Wnt受体FZD3及Wnt配体Wnt2B和Wnt7B的mRNA相对表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）. 结论 Curcumin能提高人ESCs向RPE样细胞的定向诱导效率,其主要机制可能是通过促进Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进iRPE细胞的分化和成熟。