用定量PCR从杂交阳性融合噬菌斑中分离候选插入片段

摘要

目的 为了在cDNA文库杂交筛选目的基因过程中,当复筛的杂交信号对应于1个多克隆融合噬菌斑时,能够快速、准确地分离出特异克隆的插入片段.方法 依据定量PCR扩增的原理,利用初始模板量的不同,通过两次PCR反应,鉴定和分离出所需cDNA片段.结果 利用这一方法,在β-1,4-半乳糖苷转移酶cDNA的"步移"复筛中,从一个双克隆融合斑中,得到了特异性克隆的插入片段,经测序证实为β-1,4-半乳糖苷转移酶的5′cDNA序列,长1.9kb,从而完成了全长cDNA的克隆,节省了进行再次复筛的时间和材料.结论 该方法简便、快捷,可以显著地节省时间和实验材料,在新基因克隆中有一定的实用价值.