AML1-MTG16融合基因的构建及其致瘤性的研究

摘要

目的研究用重叠延伸剪接术(splicing overlaping extension,SOE)方法获取少见融合基因的转录本.了解AML1-MTG16融合基因的致瘤性.方法通过SOE重组,将AML1、MTG16基因的两个片段经PCR融合起来,形成AML1-MTG16融合基因的编码部分.将MTG16, AML1-MTG16融合基因及切除AML1-MTG16融合基因Ⅲ、Ⅳ两个功能域(motif)的基因片段(AML1-MTG16-SⅡ)分别插入pEGFP-C1,pDsRed-N1载体中,利用脂质体转染NIH3T3细胞,48小时后激光共聚焦显微镜观察.后G418 500 μg/ml筛选1月,获稳定转染细胞后绘制生长曲线;做软琼脂克隆形成实验及裸鼠致瘤实验.结果测序结果表明,利用SOE重组获得的DNA片段含有AML1-MTG16融合基因完整的CDS部分.比较pEGFP-C1、 pEGFP-C1-AML1-MTG16质粒稳定转染的NIH3T3细胞的生长曲线,后者增殖明显.软琼脂克隆形成试验显示,转染了pEGFP-C1的NIH3T3细胞在6孔板内未形成克隆;转染了pEGFP-C1-AML1-MTG16的NIH3T3细胞在6孔板内每孔平均形成(47.7±2.7)个克隆,且使裸鼠致瘤.通过激光共聚焦显微镜观察,融合有MTG16、AML1-MTG16、AML1-MTG16-SⅡ基因片段的绿荧光蛋白或红荧光蛋白在胞核表达,MTG16 与AML1-MTG16、AML1-MTG16-SⅡ基因片段者间具有细胞核内共定位的特点.结论 SOE是一种获取少见融合基因以进行研究的简便易行的方法.生长曲线及软琼脂实验初步表明AML1-MTG16融合基因具有促发肿瘤的特点.激光共聚焦显微镜观察结果提示,AML1-MTG16的致瘤性与其核基质定位变化密切相关.MTG16的N-末端氨基酸在AML1-MTG16致瘤中可能发挥重要作用.