小鼠p16INK4a基因外显子1α胚胎干细胞条件打靶研究

摘要

目的研究打靶载体的结构与打靶效率的关系,探讨小鼠p16INK4a基因在活体水平上抑制肿瘤发生和发展的功能.方法利用筛选基因组文库得到的小鼠p16INK4a基因组DNA片段,设计并构建了针对小鼠p16INK4a基因外显子1α的条件打靶载体,其短臂为2.0 kb EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ片段,长臂为5.9 kb Spe Ⅰ/Not Ⅰ片段,上游交叉位点(locus of crossing-over,loxP)位于外显子1α起始密码上游240 bp处, 下游loxP位于外显子1α起始密码下游1633 bp处,经重组酶(Cre)介导后可将外显子1α和选择标记Neo基因同时删除.结果将此条件打靶载体通过电穿孔转导小鼠胚胎干细胞,获得24个药物抗性克隆,其中1个经Southern杂交证实为正确同源重组克隆.结论在同源臂两侧各用一个TK基因可以获得较高的正确同源重组率.