靶向人端粒酶逆转录酶基因小片段干涉RNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

摘要

目的 通过构建靶向人端粒酶催化亚基人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)RNA干涉(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础.方法 根据hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒,生成含RNAi盒的载体,然后与pCMV-dR8.74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞,包装成慢病毒,收集上清浓缩病毒并检测其滴度.所得病毒感染U87胶质瘤细胞,逆转录PCR和端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)检测干扰后细胞内hTERT表达变化及端粒酶表达变化,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒.逆转录PCR和TRAP检测结果证实构建的hTERT-小片段干涉RNA(small interference RNA,siRNA)慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性并导致细胞凋亡.结论 成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病毒载体.该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性并导致细胞凋亡,为以hTERT为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础.