乙型肝炎病毒B和C基因型全基因组的克隆与真核细胞表达

摘要

目的构建B和C基因型重组HBV表达载体,检测其在Huh7细胞内的DNA复制和HBsAg、HBeAg的表达。方法扩增B和C基因型HBV全基因组,并将其连接于真核表达载体pHY106,将这2个载体分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照。Southern印迹法检测转染72 h后HBV DNA的复制,实时定量PCR检测转染后24、48、72、96和1 20 h Huh7细胞内HBV DNA水平,ELISA检测转染后24、48、72、96和1 20 h细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的表达。结果成功构建了B和C基因型HBV表达载体。转染Huh7细胞后72 h,Southern印迹法检测到细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括松弛环状DNA、双链DNA和单链DNA。实时定量PCR检测发现病毒DNA复制水平可达8 lg拷贝/mL,ELISA结果显示HBsAg和HBeAg的表达于转染后72 h达高峰,然后逐渐下降。结论成功构建B和C基因型重组HBV真核表达载体,并能在Huh7细胞内高水平复制和表达,为进一步研究HBV的结构与功能、基因表达与调控,以及抗HBV药物的筛选等提供了良好的平台。