斑马鱼PKR剪接异构体克隆、鉴定及转录表达分析

摘要

目的:克隆斑马鱼PKR(ZPKR)及其剪接异构体(ZPKRV)并对其进行鉴定和转录表达分析.方法:采用基因克隆法克隆ZPKR及ZPKRV;利用生物信息学方法分析其结构差异,设计定量分析引物;使用病毒双链RNA类似物(Poly I:C)刺激,提取斑马鱼组织总RNA并反转录合成cDNA,通过qPCR检测ZPKR及ZPKRV转录表达的差异,推测ZPKR及ZPKRV的功能.结果:首次在斑马鱼组织中克隆到ZPKRV;生物信息分析显示,ZPKRV仅仅在ZPKR的双链RNA结合结构域和激酶区之间的链接区缺失了28个氨基酸残基,并且缺失的序列包括链接区的碱性区;Poly I:C刺激后的转录表达显示,在刺激后的12 h,ZPKR表达上调到第一个峰值,24 h又下调,48 h再上调;而ZPKRV仅在刺激后24 h表达上调到最高,然后下调.结论:ZPKRV碱性区的缺失,可能会导致其单链RNA结合功能的丧失,进而促进蛋白的翻译表达;ZPKR和ZPKRV同时表达,可能通过显性的负效应,降低PKR在抗病毒免疫反应中对蛋白翻译的抑制作用,促进抗病毒免疫细胞因子的翻译表达.