猪IgGIIB类Fc受体剪接异构体克隆与活性鉴定

摘要

目前研究发现PRRSV感染中存在抗体依赖性增强现象，亚中和剂量抗体能结合靶细胞表面 Fc受体而增强病毒的感染。Fc受体主要有 Fcγ RⅠ(CD64)、Fcγ RⅡ(CD32)、Fcγ RⅢ(CD16)和 FcgRⅣ四个亚群， Fcγ RⅡ(CD32)在人发现存在 FcγRⅡA，Fcγ RⅡB和 Fcγ RⅡC三种亚型。Fcγ RⅡB是抑制型受体，已在人、小鼠和牛上发现了两类主要的剪接异构体。本实验克隆并鉴定了猪 Fcγ RⅡB剪接异构体，为研究其介导 PRRSV侵入细胞的机制奠定基础。
　　 根据 GenBank中猪 IgGⅡB类 Fc受体(swFcγ RⅡB)(DQ026064) cDNA基因序列，利用Primer软件设计合成了一对特异性引物，应用 RT—PCR技术，从猪外周血白细胞 cDNA中扩增 swFcγ RⅡB基因，将扩增的基因片段插入到 pTG19-T载体中，进行序列测定和分析。结果表明，克隆的 swFcγ RⅡB基因序列(FJ608551)长度为951bp，编码316个氨基酸，包括45个氨基酸的 N-端信号肽序列，179个氨基酸的胞外区序列，23个氨基酸组成的疏水跨膜区序列，69个氨基酸的胞质尾区序列；其胞外区有5个 N-糖基化位点和4个半胱氨酸残基形成 Ig样结构的2个二硫键；依据 Ig保守结构，Cys71和 Cys113形成第一个 Ig样 EC1结构域，Cys152和 Cys196形成第二个 Ig样 EC2结构域。克隆序列与发表的swFcγ RⅡB(DQ026064)的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为99.3％和98.3％，其胞质尾区多19个氨基酸的插入，与人类 Fcγ RⅡb1剪接异构体相似。
　　 根据克隆的猪 Fcγ RⅡB剪接异构体 cDNA基因序列，利用 Primer软件设计合成四对特异性引物，扩增信号肽加胞外区、胞外区、EC1结构域和 EC2结构域的 DNA片段，经 kpnⅠ和EcoRⅠ双酶切后亚克隆到原核表达载体 pET-32a中，分别构建了 pET—ZY、pET—EY、pET—AY和 pET-BY四种重组表达质粒，在 IPTG诱导下成功表达 swFcγRⅡb1-ZY、swFcγRⅡb1-EY、swFcγ RⅡb1-AY、swFcγ RⅡb1-BY四种融合蛋白，均以不溶性包涵体的形式存在。swFcγ RⅡb1-ZY、swFcγ RⅡb1-EY、swFcγ RⅡb1-AY、swFcγ RⅡ61-BY四种融合蛋白经纯化后分别免疫小鼠，制备抗融合蛋白抗体，经 ELISA检测，效价分别为1：5120、1：5120、1：5120、1：10240。Western blotting检测表明，制备的多抗可以与各自的融合蛋白特异性结合，表明制备的多克隆抗体具有高度特异性。
　　 本试验将克隆的swFcγ RⅡB剪接异构体 cDNA基因亚克隆至pcDNA3.0真核表达载体中，构建了质粒pcDNA3-swFcγ RⅡb1，利用脂质体瞬时转染 COS-7细胞，经流式细胞术检测，发现 swFcγ RⅡB剪接异构体在 COS-7细胞表面表达。同时转染细胞经 G418筛选，4周后用间接免疫荧光检测，发现 swFcγ RⅡB剪接异构体能在 COS-7细胞中稳定表达，表明建立了稳定表达 swFcγ RⅡB剪接异构体的 COS-7细胞系。通过稳定表达 COS-7细胞系的红细胞吸附试验，证明了 swFcγ RⅡB剪接异构体结合 IgG免疫复合物的生物学活性。本试验研究结果将为进一步研究swFcγ RⅡB剪接异构体功能作用及其介导的 PRRSV侵入细胞的相互作用机制奠定基础。