鸭TLR4基因可变剪接体的克隆、鉴定及组织表达分析

摘要

选取同批出雏金定鸭(无母源抗体)，由国家级水禽种质资源基因库(泰州)提供，3日龄时选取体重相当，精神状态较好的80只雏鸭，即试验组(40只)、对照组(40只)。试验组注射0.4mL(0.5mg/mL)PolyI:C，对照组注射0.4mL生理盐水，隔离饲养，分别于0，4,8,12,24,36,48,72,96h分不同时间点采集胸腺、肝脏、脾脏、肺、肾脏等组织样(其中对照组脾脏取两份样品，一份用于基因克隆，另一份用于基因表达)和血样，样品于液氮中速冻-70℃冻存，提取血液及组织DNA用于PCR及RT-PCR 。以鸭脾脏组织cDNA为模板，将RT-PCR产物纯化后，转化克隆，随机挑取单个菌落进行菌液PCR，扩增得到了大小不等片段，经测序，一条为2532bp，与GenBank提交序列一致，定义为野生型(TLR4-a)，另一条为3367by，经比对，与鸭TLR4基因CDS相比，除包含相同的序列之外，还多出835by的碱基序列，定义为突变型(TLR4-b)，经多次测序确定为鸭TLR4基因的一种新的剪接体，并提交至GenBank。以鸭基因组DNA为模板，扩增鸭TLR4基因，经克隆测序。经过对TLR4-b序列结构进行研究发现，由于其保留了第一内含子(835bp)，因此TLR4-b在翻译过程中可能存在两种情况，其一是在291bp处提前终止(PTC)，仅编码76氨基酸残基;其二，发生整码突变(RFS)，从967bp开始翻译，造成1-77位的氨基酸的缺失，导致细胞膜上蛋白质多肤链第一个跨膜区片段缺失，究竟属于哪种情况还需通过蛋白功能和免疫原性实验进一步证实。