利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法与应用

摘要

本发明公开了一种利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法与应用。该方法基于3’GSP1的反转录PCR，利用梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度，基于GSP的巢式PCR测序并基于序列分析判定是否为新的剪接变体。本方法简便易行、重复性好、稳定性高、可靠性强，并且极大地节约了实验成本，可应用于不同生理病理状态下真核生物低丰度表达基因的挖掘和高、低丰度表达基因剪接变体的鉴定及发现中，可用于挖掘低丰度表达基因和鉴定与发现高表达基因及低丰度表达基因的剪接变体，除了靶定基因已知的剪接变体外，更可用于基因未知剪接变体的发现，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，特别是涉及一种利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法，该方法可应用在不同环境下低丰度表达基因以及可变剪接变体表达的相关研究和评估中。 

背景技术

研究报道，高等真核生物约有95％的基因发生可变剪接。基因在特定环境下表达特定的剪接形式，后者往往是某些疾病的生物标记，也可能是导致这些疾病的原因，因此尽可能多地发现重要基因的可变剪接形式在生物学和医学研究方面意义重大。但是，由于某些基因的转录本丰度异常低，这就给在组织特定阶段、生理或病理条件下确定特异剪接变体的种类以及特殊转录本的外显子组成带来了一定的困难。同时，越来越多的证据表明低丰度表达基因在重要生物过程中起着举足轻重的作用，例如低丰度表达基因剪接变体与细胞分化、新陈代谢和表型改变等有着密切的关系，并且可能是生物进化过程中的一个重要驱动力，然而由于低丰度表达基因的低转录本和高异质性，导致人们对于低丰度表达基因转录本的认识还处于一个初始阶段。 

为了深入认识低丰度表达基因的结构和功能，目前已发展了多种技术方法来寻找和鉴定低丰度表达基因及其剪接变体，主要包括表达序列标签(EST)预测、基因表达的序列分析(SAGE)、RNA-Seq预测、mRNA差异显示PCR(DD-PCR)、代表性差异分析(RDA)、酶降解消减、接头捕获消减、物理移除共同序列、差异消减展示(DSD)、限制性标记cDNA扫描、靶长链多态性标记消减、抑制消减杂交(SSH)、cDNA末端快速扩增(RACE)、SMART-RACE和实时定量PCR等技术。这些技术虽然能够在一定程度上获取低丰度表达基因，但又存在其自身的缺点，如假阳性高、稳定性差、步骤繁琐、工作量大、周期长、成本过高等，使其难以普遍推广应用，因而目前尚无挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的有效方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的基 因特异引物(gene-specific primer，GSP)。 

本发明所提供的基因特异引物(GSP)，是由引物设计软件或其它类似功能的引物设计软件设计完成，基因特异引物(GSP)包括3’GSP(靠近3’端)和5’GSP(靠近5’端)，并且要求尽量靠近两端。除了一般PCR的引物所必须具备的条件之外，基因特异引物(GSP)还需在热力学特征上满足基因特异性(非单纯序列比对水平)的要求。 

用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定基因的不同剪接变体的基因特异引物(GSP)是在待鉴定基因的已知剪接变体所对应的全长cDNA序列范围内，寻找可能的候选引物区域，并以DNA杂交探针(hybridization probe)和反转录引物的形式设计出3’GSP，然后将设计好的3’GSP直接用于反转录过程和巢式PCR反应，用以挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体。 

具体来讲，所述基因特异引物(GSP)的设计由Primer3程序自动完成，程序设计主要思路如下： 

1)从NCBI GenBank数据库中获取某一基因剪接变体的序列，并根据GenBank数据库记录或使用splign、gmap、blat、blast等软件解析其基因结构； 

2)在全长cDNA序列范围内寻找可能的候选引物区域； 

3)为候选引物打分(Score)，由三个部分组成，即S＝S_basic+S_end+S_genome； 

a)引物质量基本分数(S_basic)：按照常规引物质量评估体系进行打分，即引物长度为18～25bp、GC含量约50％、Tm约58℃，与这些参数越接近的引物打分越高； 

b)引物与基因两端距离分数(S_end)：按照GSP的要求，即越靠近两端打分越高，针对5’GSP和3’GSP分别打分； 

c)全基因组引物特异性控制分数(S_genome)：从热力学的角度全基因组扫描可能的引物靶定位点，位点越少(除靶基因之外)打分越高； 

4)按照打分情况排序候选引物，并取打分最高的前5条引物作为用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的引物。 

在上述基因特异引物(GSP)的设计方法中，步骤4)中通常提供前5条引物备选，如果经过筛选之后，不能获得5条备选引物，那么则根据实际情况降低引物筛选标准，选择前1-4条引物作为备选即可。 

具体来讲，优选的针对野生型秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的已知剪接变体设计的5’GSP1的核苷酸序列如序列表中序列1所示，3’GSP1的核苷酸序列如序列表中序列2所示，3’GSP2的核苷酸序列如序列表中序列3所示，3’GSP3的核苷酸序列如序列表中序列4所示；针对小鼠BDNF基因的已知剪接变体设计的5’GSP5的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’GSP6的核苷酸序列如序列表中序列6所示，3’GSP4的核苷 酸序列如序列表中序列7所示。 

本发明的第二个目的是提供一种简便易行、重复性好、稳定性高、可靠性强、成本节约型的利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法。 

本发明所提供的挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法，是利用巢式PCR结合所述基因特异引物(GSP)的反转录技术。 

所述利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)的反转录技术，是由不同丰度基因的基因特异引物(GSP)直接参与反转录，继而进行巢式PCR的方法。 

具体来讲，所述挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法可包括以下步骤：

1)基于3’GSP1的反转录PCR(RT-PCR)； 

2)利用梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度； 

3)基于GSP的巢式PCR； 

4)对巢式PCR扩增产物进行测序(包括凝胶回收、连接、转化、克隆、挑克隆摇菌、菌液PCR鉴定、提质粒、酶切鉴定和测序的步骤)； 

5)基于生物信息学的序列结果分析，判定是否为新的剪接变体。 

在上述方法中，所述步骤1)中基于3’GSP1的20μl反转录体系及反转录方法为：(1).总RNA 1μg，对应基因10pmol/L 3’GSP1 1μl，RNase Free H₂O补齐至12μl，混匀后，65℃5min，然后立即置于冰上；(2).5×RT buffer 4μl，dNTP Mixture 2μl，RNase inhibitor 1μl，反转录酶1μl；将(1)和(2)中溶液混匀后按以下程序进行反转录：先30℃10min，然后40℃40min，再85℃5min，最后4℃停止。 

所述步骤2)中梯度PCR的12.5μl反应体系为：ddH₂O 9.187μl，10×Ex Taq buffer 1.25μl，dNTP MIxture 1.0μl，Ex Taq 0.063μl，上、下游引物各0.25μl，模板(即步骤1)的RT-PCR产物)0.5μl；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃45s→不同梯度退火温度(梯度依次为55.0℃、55.5℃、56.8℃、58.8℃、60℃、61.1℃、62℃、63.3℃、65.7℃、67.9℃)各45s→72℃1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后4℃停止。 

所述步骤3)中针对野生型秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的巢式PCR共分三轮进行，反应体系为12.5μl，包括：ddH₂O 9.187μl，10×Ex Taq buffer 1.25μl，dNTP Mixture 1.0μl，Ex Taq 0.063μl，上、下游引物各0.25μl，模板0.5μl；第一轮巢式PCR反应体系中，模板为反转录产物，上、下游引物分别为5’GSP1和3’GSP1；第二轮巢式PCR反应体系中，模板为第一轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶 液，上、下游引物分别为5’GSP1和3’GSP2；第三轮巢式PCR反应体系中，模板为第二轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP1和3’GSP3；反应条件为：先95℃预变性5min；然后95℃45s→最佳退火温度(根据所摸索的扩增秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的退火温度，确定三轮均为60℃)45s→72℃1min，35个循环；72℃延伸5min；最后4℃停止。 

所述步骤3)中针对小鼠BDNF基因的巢式PCR共分五轮进行，反应体系为12.5μl，包括：ddH₂O 9.187μl，10×Ex Taq buffer 1.25μl，dNTP Mixture 1.0μl，Ex Taq 0.063μl，上、下游引物各0.25μl，模板0.5μl；第一轮巢式PCR反应体系中，模板为反转录产物，上、下游引物分别为5’GSP4和3’GSP2；第二轮巢式PCR反应体系中，模板为第一轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP4和3’GSP3；第三轮巢式PCR反应体系中，模板为第二轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP4和3’GSP4；第四轮巢式PCR反应体系中，模板为第三轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP5和3’GSP4；第五轮巢式PCR反应体系中，模板为第四轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP6和3’GSP4；反应条件为：先95℃预变性5min；然后95℃45s→最佳退火温度(根据所摸索的扩增小鼠BDNF基因的退火温度，确定五轮巢式PCR均为62℃)45s→72℃1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后4℃停止。 

用上述方法得到的新物质也属于本发明的保护范围。所述新物质包括新的低丰度表达基因剪接变体。 

其中，野生型秀丽隐杆线虫N₂株系glb-18基因的新的低丰度表达基因剪接变体的核苷酸序列可如序列表中序列8所示，小鼠BDNF基因的新的低丰度表达基因剪接变体的核苷酸序列可如序列表中序列9所示。 

本发明提供了一种利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法。该技术的核心首先是GSP的设计，原因是GSP可特异、高效地富集和扩增待鉴定基因，提高低丰度表达基因的挖掘效率，其次是巢式PCR扩增，原因是巢式PCR技术可特异性地扩增出低丰度表达基因和基因的剪接变体；该技术的原理为：1)基于3’GSP1的反转录PCR(RT-PCR)，特异性地获得待鉴定基因的cDNA，特别是对于低丰度表达基因，可有效抑制其它基因的扩增；2)利用梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度，可保证低丰度表达基因的高效扩增；3)基于GSP的巢式PCR可以特异性地获得待鉴定基因，而非待鉴定基因则无法被扩增出来。本发明可以用于多种生命体的不同生理状态下基因表达的研究，如大肠杆菌、酵母、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、小鼠和细胞等，并且可以通过对不同低丰度表 达基因设计GSP，针对不同生命体的不同研究需求进行调整和优化。本方法简便易行、重复性好、稳定性高、可靠性强，并且极大地节约了实验成本，能够替代现有的常规技术，可应用于不同生理病理状态下真核生物低丰度表达基因的挖掘和高、低丰度表达基因剪接变体的鉴定及发现中(所述技术不仅可应用于挖掘低丰度表达基因，更可用于鉴定和发现高表达基因及低丰度表达基因的剪接变体，此外，除了靶定基因已知的剪接变体外，更可用于基因未知剪接变体的发现)，应用前景广阔。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 

附图说明

图1为本发明利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法的流程图 

图2为针对同一基因不同剪接变体的GSP设计方式(秀丽隐杆线虫glb-18基因特异引物设计信息) 

图3为BDNF基因特异引物设计信息 

图4为针对野生型秀丽隐杆线虫N2株系glb-18基因的巢式PCR产物电泳图谱 

图5为针对小鼠BDNF基因的巢式PCR产物电泳图谱 

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 

实施例1：用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的基因特异引物(GSP)的设计 

基因特异引物(GSP)的设计由Primer3程序自动完成，程序设计主要思路如下： 

5)从NCBI GenBank数据库中获取某一基因剪接变体的序列，并根据GenBank数据库记录或使用splign、gmap、blat、blast等软件解析其基因结构； 

6)在全长cDNA序列范围内寻找可能的候选引物区域； 

7)为候选引物打分，由三个部分组成，即S＝S_basic+S_end+S_genome： 

a)引物质量基本分数(S_basic)：按照常规引物质量评估体系进行打分，即引物长度18～25bp、GC含量约50％、Tm约58℃，与这些参数越接近的引物打分越高。 

b)引物与基因两端距离分数(S_end)：按照GSP的要求，即越靠近两端打分越高，针对5’GSP和3’GSP分别打分； 

c)全基因组引物特异性控制分数(S_genome)：从热力学的角度全基因组扫描可能的引物靶定位点，位点越少(除靶基因之外)打分越高； 

8)按照打分情况排序候选引物，并取打分最高的前5条引物(备选)作为用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的引物。通常提供前5条引物备选。如果经过筛选之后，不能获得5条备选引物，那么则根据实际情况降低引物筛选标准，选择前1-4条引物作为备选即可。 

分别以野生型秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因和小鼠BDNF基因的已知剪接变体为例进行引物设计(图2为glb-18基因的引物设计信息(针对同一基因不同剪接变体F52A8.4b和F52A8.4a的GSP设计方式)；图3为以BDNF基因其中一个剪接变体001048139.1为例的巢式PCR模式图(1、2、3、4、5分别代表巢式PCR的顺序及引物组合；5G4、5G5、5G6分别代表上游引物；3G1、3G2、3G3、3G4分别代表下游引物)。引物序列如下： 

针对野生型秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的已知剪接变体(GenBank号：NM_001136303.1)设计的特异引物： 

5’GSP1：tgccgtctgctgctcgtcaa(序列表中序列1)； 

3’GSP1：ggcggaaaacgattgacacctttca(序列表中序列2)； 

3’GSP2：tcctccacaccgtcactgcg(序列表中序列3)； 

3’GSP3：tcggtcataatggagagacggtgtt(序列表中序列4)。 

针对小鼠BDNF基因的已知剪接变体(GenBank号：001048139.1)设计的特异引物： 

5’GSP5：cgaggttcggctcacaccga(序列表中序列5)； 

5’GSP6：agccccagtttggtcccctc(序列表中序列6)； 

3’GSP4：gagtcccatgggtccgcaca(序列表中序列7)。 

实施例2：利用基因特异引物(GSP)结合巢式PCR技术在鉴定和发现低丰度表达基因中的应用 

利用基因特异引物(GSP，以实施例1设计的引物为例)结合巢式PCR技术在鉴定和发现低丰度表达基因中的应用，具体方法包括以下步骤(流程图如图1所示)： 

一、依赖于3’GSP1的RNA反转录 

以提取的总RNA(野生型秀丽隐杆线虫N₂株系或小鼠)为模板，反转录出相应基因cDNA第一链。基于3’GSP1的20μl反转录体系及反转录方法为(所用试剂购自TOYOBO公司)：(1).总RNA 1μg，对应基因10pmol/L 3’GSP1 1μl，RNase Free H₂O 补齐至12μl，混匀后，65℃5min，然后立即置于冰上；(2).5×RT buffer 4μl，dNTP Mixture 2μl，RNase inhibitor 1μl，反转录酶1μl；将(1)和(2)中溶液混匀后按以下程序进行反转录：先30℃10min，然后40℃40min，再85℃5min，最后4℃停止。瞬时离心后，-20℃保存待用。 

二、利用温度梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度 

实验中分别针对野生型线虫N₂株系中7个低丰度表达基因(egl-9(GenBank号：NM_001028661.2、NM_171533.3、NM_001028663.2、NM_001047640.1、NM_001028662.1)、hif-1(GenBank号：NM_075607.4、NM_001028720.2、NM_001028722.2、NM_001028721.1)、glb-3(GenBank号：NM_073431.1)、glb-5(GenBank号：NM_001129381.1、NM_072065.2)、glb-8(GenBank号：NM_059706.2、NM_001136283.1)、glb-13(GenBank号：NM_077678.4)、glb-18(GenBank号：NM_001136303.1、NM_059673.5))和小鼠低丰度表达基因BDNF的不同引物组合进行温度梯度PCR，每对引物PCR的反应体系为12.5μl，包括：ddH₂O 9.187μl，10×Ex Taq buffer 1.25μl，dNTP Mixture 1.0μl，Ex Taq 0.063μl，上、下游引物各0.25μl，模板(即步骤一的RT-PCR产物)0.5μl；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃45s→不同梯度退火温度(梯度依次为55.0℃、55.5℃、56.8℃、58.8℃、60℃、61.1℃、62℃、63.3℃、65.7℃、67.9℃)各45s→72℃1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后4℃停止。反应结束后，对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，具体步骤如下：将PCR产物(12.5μl)与6×Loading buffer(2.5μl)混匀后，加入含GoldView^TM核酸染料的2％琼脂糖凝胶中，稳压120V电泳50min，利用凝胶成像仪将电泳后的琼脂糖凝胶拍照并保存。通过分析凝胶图像，寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度。 

三、结合基因特异引物的巢式PCR 

针对野生型线虫N₂株系的glb-18基因的巢式PCR共分三轮进行，反应体系为12.5μl，包括：ddH₂O 9.187μl，10×Ex Taq buffer 1.25μl，dNTP Mixture 1.0μl，Ex Taq 0.063μl，上、下游引物各0.25μl，模板0.5μl；第一轮巢式PCR反应体系中，模板为反转录产物，上、下游引物分别为5’GSP1和3’GSP1；第二轮巢式PCR反应体系中，模板为第一轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP1和3’GSP2；第三轮巢式PCR反应体系中，模板为第二轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP1和3’GSP3；反应条件为：先95℃预变性5min；然后95℃45s→最佳退火温度(根据所摸索的扩增秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的退火温度，确定三轮均为60℃)45s→72℃1min，35个循环；72℃延伸5min；最后4℃停止。对PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，具体步骤如下： 将PCR产物(5μl)与6×Loading buffer(1.5μl)混匀后，加入含GoldView^TM核酸染料的2％琼脂糖凝胶中，稳压120V电泳50min，利用凝胶成像仪将电泳后的琼脂糖凝胶拍照分析。 

针对小鼠BDNF基因的巢式PCR共分五轮进行，反应体系为12.5μl，包括：ddH₂O 9.187μl，10×Ex Taq buffer 1.25μl，dNTP Mixture 1.0μl，Ex Taq 0.063μl，上、下游引物各0.25μl，模板0.5μl；第一轮巢式PCR反应体系中，模板为反转录产物，上、下游引物分别为5’GSP4和3’GSP2；第二轮巢式PCR反应体系中，模板为第一轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP4和3’GSP3；第三轮巢式PCR反应体系中，模板为第二轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP4和3’GSP4；第四轮巢式PCR反应体系中，模板为第三轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP5和3’GSP4；第五轮巢式PCR反应体系中，模板为第四轮巢式PCR产物稀释10倍后的溶液，上、下游引物分别为5’GSP6和3’GSP4；反应条件为：先95℃预变性5min；然后95℃45s→最佳退火温度(根据所摸索的扩增秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的退火温度，确定五轮巢式PCR均为62℃)45s→72℃1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后4℃停止。对PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测方法与上述相同。 

实验结果显示，巢式PCR结合基因特异引物(GSP)反转录技术不仅能够特异性地钓出某个剪接变体上期望长度的目的片段，并且除了目的片段外还有一些特异性的条带也可被钓取出来。图4和图5分别为针对野生型秀丽隐杆线虫N₂株系glb-18基因和小鼠BDNF基因剪接变体的实验结果。图4中用红线标出的条带为依次钓出的剪接变体，绿框标出的条带为呈逐步递减规律的特异性条带。图5中用红线标出的条带为依次钓出的剪接变体，绿框和黄框标出的条带为呈逐步递减规律的特异性条带。 

四、测序及序列分析 

针对目的条带和特异条带进行凝胶回收、连接、转化、克隆、挑克隆摇菌、菌液PCR鉴定、提质粒、酶切鉴定、测序并对测序结果进行分析(Biochem Biophys Res Commun，A lentiviral vector with novel multiple cloning sites：stable transgene expression in vitro and in vivo，2008，371(3)：546-50；Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，Cloning and sequence analysis of SOCS-2 gene in pig，2007，23(6)：1091-6)后，确定是已知剪接变体或新的剪接变体。针对测序结果，利用生物信息学软件分析后，发现其中对应于野生型秀丽隐杆线虫N₂株系glb-18基因和小鼠BDNF基因(绿框中的特异条带)的特异条带即分别为对应基因的新的剪接变体。其中，野生型秀丽隐 杆线虫N₂株系glb-18基因的新的剪接变体的核苷酸序列如序列表中序列8所示，小鼠BDNF基因的新的剪接变体的核苷酸序列如序列表中序列9所示。 

五、提交序列 

针对新的剪接变体，用Sequin软件将序列整理为GenBank格式，提交给NCBIGenBank数据库。经Sequin软件处理后的两个新的剪接变体的GenBank提交格式如下： 

1、野生型秀丽隐杆线虫N₂株系glb-18基因的新的剪接变体 

2、小鼠BDNF基因的新的剪接变体