抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

摘要

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆H CVF蛋白反式激活相关基因.方法以HCV F表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组c D N A进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与T/A载体连接,构建c D N A消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析.结果成功构建人H CV F蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到5 6个2 00～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中2 8个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得1 9种编码基因,其中2个为未知功能的新基因.结论筛选到的cD N A全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因.