应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

摘要

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV E2蛋白反式调节相关基因.方法以HCV E2表达质粒pcDNA3.1(-)-E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HCV E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1 000 bp插入片段.挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因.通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中.结论应用SSH技术成功构建了HCV E2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HCV E2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据.