CRISPR/Cas9介导的microRNA-21敲除对慢性髓性白血病细胞伊马替尼敏感性的影响

摘要

目的 观察microRNA-21 (miR-21)敲除对耐伊马替尼的人慢性髓性白血病细胞株K562/G01细胞在增殖、药物敏感性等方面的影响,初步探讨miR-21影响K562/G01细胞伊马替尼敏感性的可能机制.方法 运用CRISPR/Cas9技术敲除K562/G01细胞的miR-21,经PCR筛选、Sanger测序鉴定和实时定量PCR检测获得miR-21敲除的单细胞克隆.扩增培养后,采用MTT法、细胞克隆形成实验检测miR-21敲除对K562/G01细胞增殖的影响.使用伊马替尼处理细胞后,用MTT法和Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞检测法观察敲除miR-21后K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性的变化.Western blot法检测miR-21敲除前后K562/G01细胞PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、P210BCR-ABL、p-P210BCR-ABL蛋白表达量的变化.结果 成功构建了3个miR-21敲除的K562/G01单细胞克隆,CRISPR/Cas9介导的突变效率为7.12％～8.11％.miR-21敲除使K562/G01细胞的增殖受抑,野生型和1≠#、2≠≠、6#单细胞克隆的克隆形成率依次为(57.67±8.25)％、(26.94±5.36)％、(7.17±2.11)％、(31.50±3.65)％,差异有统计学意义(JP＜0.05).miR-21敲除使K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性增加,野生型和1#、2#、6#单细胞克隆对伊马替尼的IC50值分别为(21.92±1.36)μmol/ml、(3.98±0.39) μmol/ml、(5.38±1.01)μmol/ml、(9.24±1.36)μmol/ml,差异有统计学意义(P＜0.05).miR-21敲除后,其靶基因PTEN的蛋白表达水平未见明显变化,但PI3K、AKT信号分子的活化受到抑制,并且P210BCR*ABL、p-P210BCR-ABL蛋白表达也下调.结论 miR-21敲除抑制K562/G01细胞增殖,提高其对伊马替尼的敏感性,这可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路和BCR-ABL表达实现的.