IL-17和siRNA-IL-17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL-17的表达

摘要

目的 构建含有Thy1.1细胞表面抗原(Thy-1.1 cell surface antigen,Thy1.1)基因的携带IL-17或siRNA-IL-17基因的逆转录病毒载体,并观察逆转录病毒对致糖尿病性BDC2.5 T细胞的转染能力.方法 利用基因工程和细胞克隆技术分别将IL-17的cDNA插入MSCV-IRES-Thy1.1(MIT)逆转录病毒载体,将Thy1.1、U6增强子(U6 promoter)基因和IL-17的siRNA cDNA插入逆转录病毒载体pMND-BANSHEE,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染293包装细胞;收集病毒上清,转染预先活化的NOD/BDC小鼠脾细胞,测定致糖尿病性T细胞的IL-17和siRNA-IL-17的表达.结果 流式细胞术检测显示,成功构建携带IL-17和siRNA-IL-17的逆转录病毒载体.携带IL-17或siRNA-IL-17逆转录病毒分别感染原代培养并活化的NOD/BDC脾细胞,在空白对照组、空载体组、阳性对照组、IL-17组和siRNA-IL-17组,Thy1.1~+/Thy1.2~+细胞比例分别为(0.6±0.3)%,(7.2±2.4)%,(6.8±2.6)%,(6.4±2.4)%和(4.6±1.8)%;体外实验携带IL-17基因逆转录病毒转染BDC2.5 T淋巴细胞后,IL-17的表达显著高于siRNA-IL-17转染组和未转染对照组(均P<0.01).体外培养活化实验显示,携带IL-17逆转录病毒转染非活化组和活化组T淋巴细胞,转染后IL-17的表达均显著高于siRNA-IL-17转染组和未转染对照组(均P<0.01),其中IL-17转染活化组的IL-17的表达较非活化组更高(P<0.01);在siRNA-IL-17转染的非活化组和活化组,IL-17的表达显著降低,与未转染对照组相比无显著性差异(均P>0.05).结论 逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因IL-17或siRNA-IL-17转移至BDC/NOD T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具.