MiR-145调节G蛋白偶联受体98抑制结直肠癌细胞的奥沙利铂耐药性

摘要

目的预测鉴定miR-145靶基因,探讨miR-145抑制结直肠癌细胞株HCT116奥沙利铂（L-OHP）耐药性的机制。方法在人结直肠癌细胞株HCT116的基础上,建立人结直肠癌L-OHP耐药细胞株HCT116/L-OHP。脂质体转染法将miR-145的模拟体miRNA-mimics及阴性对照NC-miRNA转染入HCT116/L-OHP,得到过表达miR-145的细胞株HCT116/L-OHPmimics及其阴性对照HCT116/L-OHPNC。预测miR-145的靶基因并用荧光素酶方法验证。确定靶基因为G蛋白偶联受体98（GPR98）后,构建质粒并转染细胞,得到过表达GPR98的HCT116/L-OHPGPR98细胞及其对照HCT116/L-OHPcontrol;同时通过更改GPR98 cDNA中与miR-145结合的序列,得到同时过表达GPR98和miR-145的HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞。本研究采用CCK-8法检测细胞的增殖能力[吸光值（A）]值和对L-OHP的敏感性(被测拮抗剂的半抑制浓度IC50越低,代表对药物的敏感性越强)。实时定量PCR检测miR-145和GPR98的mRNA表达水平;western blot法检测GPR98和耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药蛋白1（MRP1）以及抑癌基因PTEN的蛋白表达水平。结果成功建立耐药细胞株HCT116/L-OHP[IC5O:（42.34±1.05）μg/ml,高于HCT116细胞的（9.81±0.95）μg/ml,t=39.784,P=0.000;miR-145:0.27±0.04,低于HCT116细胞的1.00±0.09,t=13.021,P=0.000]。在HCT116/L-OHP基础上,成功构建HCT116/L-OHPmimics细胞[miR-145:10.01±1.05,高于HCT116/L-OHPNC（1.06±0.14）和HCT116/L-OHP（1.00±0.16）,F=161.797,P=0.000]。GPR98经鉴定是miR-145的靶基因。HCT116/L-OHPGPR98细胞中GPR98的mRNA和蛋白相对表达分别为8.48±0.46和1.71±0.09,与HCT116/L-OHPcontrol（mRNA:3.65±0.40;蛋白:1.21±0.10）和HCT116/L-OHP（mRNA:3.49±0.35;蛋白:1.22±0.08）比较,差异有统计学意义（均P＜0.05）。HCT116/L-OHPGPR98细胞A450值为1.31±0.10,高于HCT116/L-OHP（0.82±0.08,t=6.251,P=0.000）;HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞A450值为0.89±0.08,高于HCT116/L-OHPmimics（0.20±0.05,t=11.158,P=0.000）。HCT116/L-OHPGPR98细胞中耐药蛋白P-gp和MRP1的相对表达水平分别为1.53±0.18和1.49±0.20,高于HCT116/L-OHP细胞（分别为1.00±0.06和1.21±0.13）,而抑癌蛋白PTEN的相对表达水平为0.12±0.03,低于HCT116/L-OHP细胞（1.25±0.14）,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。HCT116/L-OHPmimics+GPR98细胞P-gp和MRP1的蛋白相对表达水平分别为1.02±0.24和1.38±0.25,高于HCT116/L-OHPmimics（分别为0.20±0.07和0.55±0.10）,而PTEN的蛋白相对表达水平为1.41±0.16,低于HCT116/L-OHPmimics（1.98±0.13）,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。HCT1 16/L-OHPGPR98IC50为（73.54±1.21）μg/ml,高于HCT116/L-OHP的（41.25±1.56）μg/ml（t=25.041,P=0.000）;HCT116/L-OHPmimics+GPR98IC50为（48.80±1.75）μg/ml,高于HCT116/L-OHPmimics的（19.20±0.81）μg/ml（t=22.994,P=0.000）。结论 miR-145通过抑制靶基因GPR98的表达水平,从而抑制人结直肠癌细胞株HCT116细胞的L-OHP耐药性。