靶向人Cyclin E1基因RNA干扰真核表达载体的构建及筛选

摘要

目的构建编码细胞周期蛋白（Cyclin）E1 mRNA的短发卡样RNA（shRNA）质粒表达载体,筛选出沉默效果可靠shRNA表达载体。方法 Genebank查出Cyclin E1 mRNA编码区,以454～472及708～726位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,分别构建2个shRNA质粒表达载体和1个无关序列作为阴性对照,shRNA两端设计有BamHⅠ及HindⅢ双酶切位点,中间含SalⅠ酶切位点,与含BamHⅠ及HindⅢ双酶切位点的空质粒载体连接,重组质粒经聚合酶链反应（PCR）酶切电泳及测序鉴定。质粒转染细胞后经逆转录（RT）-PCR及Western blot检测Cyclin E1 mRNA及蛋白沉默效果。结果构建重组质粒经SalⅠ酶切后扩增形成条带与理论值一致,插入片段cDNA经测序同基因文库相符。Cyclin E1 mRNA表达率在正常对照组（ACHN）、阴性质粒转染组（pGenesil-HK）分别为:0.91±0.04、0.87±0.02,明显高于稳定转染pGenesil-Cyclin E1-shRNA1组及pGenesil-CyclinE1-shRNA2组的0.11±0.01和0.16±0.03（P＜0.05）。前两组Cyclin E1蛋白表达分别为:0.89±0.07、0.84±0.03,也显著高于后两组的0.10±0.06和0.14±0.04（P＜0.05）。结论针对人Cyclin E1基因的shRNA质粒真核表达载体pGenesil-Cyclin E1-shRNA1构建成功且沉默效果满意。