人内皮型一氧化氮合成酶基因重组腺病毒载体构建及其在人血管平滑肌细胞的表达

摘要

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建人内皮型一氧化氮合成酶基因（heNOS）重组腺病毒并检测其在体外培养人血管平滑肌细胞中表达。方法将质粒PMSCV-heNOS通过聚合酶链反应（PCR）法扩增出heNOS全长基因,插入PSUCMV中构建成腺病毒穿梭质粒PSUCMV-heNOS,转化DH5α大肠杆菌,挑选细菌单克隆进行DNA测序,酶切鉴定正确;通过PSUCMV-heNOS与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组,得到携带heNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMV-heNOS）。转染体外培养的人血管平滑肌细胞,MTT检测细胞增殖,用免疫组织化学和Western blot等方法检测heNOS蛋白的表达。结果 （1）PCR产物电泳结果,酶切鉴定和测序鉴定结果证实构建人eNOS重组腺病毒载体成功,病毒滴度达3.5×1010PFU/ml;（2）根据体外培养的人血管平滑肌细胞（HVSMCs）形态学变化,免疫组织化学进行平滑肌细胞表型标志物α-actin染色,证实为HVSMCs;（3）转染120 h,AdCMV-heNOS病毒感染复数（MOI）分别为50、150、250、300、450、A570值分别为1.410±0.081、1.357±0.150、1.303±0.311、0.995±0.248、0.73l±0.101,其中感染复数300明显稳定抑制血管平滑肌细胞的增殖,差异有统计学意义（P＜0.01）。免疫组织化学和Western blot检测显示转染细胞heNOS蛋白明显表达。结论 heNOS重组腺病毒的构建及其表达为血管内膜增生等疾病的基因治疗提供可能。