褪黑素抗人晶状体上皮细胞焦亡作用及其机制

摘要

目的探讨褪黑素对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人晶状体上皮细胞(HLECs)焦亡的影响及其机制。方法取传代培养的HLECs分为5个组,其中正常对照组常规培养,模型对照组于100μmol/L H_(2)O_(2)条件下培养,褪黑素组、维生素E组和维生素E溶剂组分别用1×10^(-6)mol/L褪黑素、100μmol/L维生素E和维生素E溶剂预处理后,用100μmol/L H_(2)O_(2)继续培养,收集细胞待检测。为进一步探讨褪黑素的作用机制,将细胞分为7个组,其中正常对照组常规培养;模型对照组细胞于100μmol/L H_(2)O_(2)条件下培养;核转录因子E2相关因子2短发夹RNA(shNrf2)阴性对照组和shNrf2组细胞分别用shNrf2阴性对照和shNrf2慢病毒转染,并于终浓度100μmol/L H_(2)O_(2)条件下培养;褪黑素组细胞在终浓度1×10^(-6)mol/L褪黑素条件下培养,然后加入终浓度100μmol/L H_(2)O_(2)继续培养;褪黑素+shNrf2阴性对照组和褪黑素+shNrf2组细胞首先分别采用shNrf2阴性对照或shNrf2慢病毒转染,再于终浓度1×10^(-6)mol/L褪黑素和终浓度100μmol/L H_(2)O_(2)条件下培养,收集各组细胞。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,白细胞介素(IL)-1β和IL-18浓度;采用流式细胞术检测各组细胞中活性氧簇(ROS)的荧光强度;采用Western blot法检测各组细胞中Nrf2、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白的表达。结果ELISA法检测发现,与模型对照组相比,褪黑素组和维生素E组细胞培养上清液中LDH活性及IL-1β和IL-18浓度均有不同程度的下调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞仪检测发现,褪黑素组和维生素E组细胞中ROS荧光强度分别为13040.67±1550.66、12593.67±1677.06,显著低于模型对照组的18310.33±1248.01,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Western blot结果显示,褪黑素组和维生素E组Nrf2蛋白相对表达量分别为4.24±0.44、3.73±0.38、较模型对照组的2.28±0.34明显上升(均P<0.05),褪黑素组和维生素E组NLRP3、ASC、caspase-1 p20及GSDMD-N蛋白相对表达量较模型对照组显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。shNrf2组相较于shNrf2阴性对照组,褪黑素+shNrf2组相较于褪黑素+shNrf2阴性对照组,细胞培养上清液中LDH活性、IL-1β和IL-18浓度均显著上升,细胞中Nrf2蛋白相对表达量明显下降,细胞中ROS荧光强度、NLRP3、ASC、caspase-1 p20及GSDMD-N焦亡相关蛋白相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论褪黑素可能通过激活Nrf2,减少NLRP3炎性体的释放,进而抑制HLECs焦亡。