动力相关蛋白-1在缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用

摘要

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）发病率高、死亡率也高，对一些重症AKI尚缺乏有效的治疗方法[1]。线粒体是细胞代谢的主要能量来源，也是调节细胞死亡的重要细胞器。细胞损伤或缺氧时，可通过激活Caspase系统或ROS的释放，启动不同类型的细胞死亡[2]。致病因素导致肾小管上皮细胞线粒体功能障碍，进而激活多种细胞死亡通路，可能是AKI发生发展的重要机制。新近研究表明，焦亡是AKI时肾小管上皮细胞死亡的主要方式，但目前对其发生机制及信号通路知之甚少。我们前期研究发现Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(ACHT，LRR and PYD domains-containingprotein3，Nlrp3)在AKI发病机制中发挥着重要作用，并在肾小管上皮细胞焦亡发生中扮演关键角色，但其上游调控通路及其机制尚不清楚。目前研究显示线粒体功能障碍在Nlrp3激活中起到了中枢作用，而动力相关蛋白-1(dynamin-related protein1，Drp1)是线粒体分裂的关键“分子开关”，参与了线粒体功能障碍的发生发展[3]。最新研究显示RNA病毒可通过Drp1介导Nlrp3的激活[4]。但是Drp1、线粒体功能障碍和Nlrp3三者之间的相互关系及调控机制尚不明了。基于上述背景，我们提出Drp1通过调控线粒体/Nlrp3轴进而介导AKI中肾小管上皮细胞焦亡的假设。本项目首先验证急性肾损伤中肾上皮细胞的焦亡效应，再通过分别干预Drp1，线粒体/Nlrp3轴，以研究Drp1、线粒体及炎症体分子之间的相互作用及调控机制，为阐释AKI中肾小管上皮细胞焦亡的发生机制，寻找AKI治疗的新靶点提供新思路。
　　内容：
　　本研究拟采用缺氧复氧(H/R)措施处理人肾小管上皮细胞（HK-2细胞），以模拟HK-2细胞缺血再灌注损伤，并检测被处理细胞的炎性因子IL-1β以及caspase-1蛋白表达水平及肾小管上皮细胞焦亡情况，探讨缺血再灌注(I/R)后人肾小管上皮细胞炎症及焦亡反应状态，并检测HK-2细胞中Nlrp3炎性体、活性氧ROS、Drp1的表达，探讨I/R导致HK-2细胞炎性因子IL-1β活化及焦亡的可能机制。同时使用Mdivi-1阻断Drp1的活性，再检测H/R的HK-2细胞中Drp1、Nlrp3炎性体表达变化，同时对H/R的HK-2细胞炎性因子IL-1β表达水平、活性氧ROS、肾小管上皮细胞焦亡及焦亡相关分子表达进行检测，研究Drp1在炎症及焦亡反应中的作用及其可能机制。
　　方法：
　　1.体外扩增siNlrp3腺病毒，计算病毒滴度和MOI值，供后续试验。
　　2.体外培养人肾小管上皮细胞，用缺氧复氧条件模拟人肾小管上皮细胞缺血再灌注模型。
　　3.用流式细胞仪观察各组细胞焦亡的情况。
　　4.采用Beckman AU5800全自动生化分析仪对各组细胞上清中乳酸脱氢酶的水平进行检测。
　　5.激光共聚焦观察各组细胞活性氧的表达水平。
　　6.采用Western blot法对Nlrp3、caspase-1、Drp1、IL-1β蛋白在各组细胞中的表达进行检测。
　　结果：
　　1.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞发生了细胞焦亡。
　　(1)正常对照组:细胞培养上清液中乳酸脱氢酶LDH为36.90±1.89 IU/L，流式细胞仪检测显示，正常对照组细胞焦亡率仅为0.115％。
　　(2)缺氧/复氧(H/R)组:缺氧复氧24h后，细胞上清液中焦亡相关分子乳酸脱氢酶显著升高达58.80±6.58 IU/L，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05）;人肾小管上皮细胞焦亡率增多至5.27％，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05），说明缺氧复氧能显著增加人肾小管上皮细胞的焦亡。
　　2.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞Nlrp3炎性体、IL-1β、caspase-1水平升高，沉默Nlrp3能减少Nlrp3炎性体、IL-1β、caspase-1表达水平，同时降低人肾小管上皮细胞焦亡率。
　　(1)正常对照组:人肾小管上皮细胞中Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平较低。
　　(2)缺氧/复氧(H/R)组:与正常对照组相比，缺氧复氧24h后，人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化增加，炎性因子IL-1β水平显著升高(P＜0.05）。
　　(3)缺氧/复氧+Nlrp3沉默腺病毒(H/R+siNlrp3)组:与缺氧/复氧(H/R)组相比，缺氧复氧24h后，人肾小管上皮细胞焦亡升高程度(1.78％)显著低于缺氧/复氧组(5.27％)(P＜0.05)，人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化减少，炎性因子IL-1β水平显著降低(P＜0.05），表明siNlrp3腺病毒能有效地减轻缺氧复氧诱导的人肾小管上皮细胞焦亡，Nlrp3参与了缺氧复氧导致的人肾小管上皮细胞焦亡。
　　3.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞中Drp1、ROS表达上调，Mdivi-1能抑制Drp1活化，减少ROS表达，同时降低Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平，并减少细胞焦亡。
　　(1)正常对照组:人肾小管上皮细胞中Drp1、ROS水平较低。
　　(2)缺氧/复氧(H/R)组:与正常组相比，缺氧复氧24h后，人肾小管上皮细胞Drp1表达显著上调(P＜0.05），细胞中活性氧表达也显著升高。
　　(3)缺氧/复氧+Mdivi-1(H/R+Mdivi-1)组:缺氧/复氧(H/R)组，Mdivi-1未能明显降低Drp1表达，但细胞中活性氧的表达显著降低，人肾小管上皮细胞焦亡升高程度(1.8％)显著低于缺氧/复氧组(5.27％)(P＜0.05），人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化减少，炎性因子IL-1β水平显著降低（P＜0.05），提示抑制Drp1活化能有效减低细胞活性氧水平，降低人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1表达，Drp1参与了缺氧复氧诱导的人肾小管上皮细胞焦亡。
　　结论：
　　1.细胞焦亡是缺氧/复氧诱导肾小管上皮细胞死亡的重要方式。
　　2.缺氧/复氧通过上调Drp1，诱导Nlrp3炎性体表达和线粒体功能障碍，进而导致人肾小管上皮细胞发生炎症反应和焦亡，是急性缺血性肾损伤的重要发生机制。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 缺氧／复氧诱导人肾小管上皮Drp1、Nlrp3、活性氧、IL-1β过表达致细胞焦亡

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 抑制Drp1激活对缺氧／复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡的影响

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 线粒体功能障碍与焦亡在急性肾损伤中的相关研究及展望

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