丙型肝炎病毒全长cDNA模板的构建及鉴定

摘要

目的构建具有功能的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆.方法应用长模板RT-PCR法扩增1份上海地区HCV感染者血清的RNA(基因型为1b),分段扩增、融合拼接成9.2kb的基因片段,克隆入含有HCV基因两端非编码区序列的载体作为模板.为检测此过程是否发生对特定变异株的选择,分析4个独立克隆的HVR1序列.对原核细胞中表达的HCV核心蛋白、NS3蛋白酶及解旋酶,以蛋白印迹实验确证其免疫反应性.并构建NS3/4A-SEAP表达系统检验NS3的蛋白酶活性.结果获得丙型肝炎病毒全长cDNA模板.不同克隆间HVR1序列存在较大差异,提示长模板RT-PCR所制备HCV cDNA具有HCV基因准种(quasispecies)的特性.该模板编码基因在原核细胞内得到高效表达,并具有良好的免疫反应性.在NS3/4A-SEAP表达系统内,NS3可切割、释放其下游的SEAP,具有蛋白酶活性.结论本工作为构建全长功能性HCV cDNA模板及感染性克隆奠定了基础.