改进探针标记法斑点杂交在轮状病毒VP7分型中的应用

摘要

目的 建立一种更加简便的A组人轮状病毒(HRV)核酸斑点杂交VP7分型方法,以便用于对HRV流行情况进行调查.方法 在HRV VP7编码基因各G基因型间高度变异而型内高度保守区域设计分型探针,在该区域的两侧相对保守区域设计一对通用引物,利用PCR分别将地高辛标记HRV 5种常见型别(G1～4,G9型)的DNA探针,建立基于VP7的斑点杂交方法;选取经抗原检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测均为HRV阳性的2006至2008年住院腹泻患儿粪便标本200份,RT-PCR扩增VP7全基因,并对扩增阳性产物应用斑点杂交方法进行G型别分析.结果 建立的斑点杂交方法在5种型别探针间无交叉反应,各型探针的检测灵敏度可达到10 pg.200份PAGE阳性标本中162份RT-RCR扩增VP7基因阳性,斑点杂交显示G1型41例(25.3%),G2型2例(1.2%),G3型63例(38.9 %),G9型35例(21.6%),混合感染19例(11.7%),杂交未分出型2例(1.2%),未检测到G4型HRV.结论 本研究所建立的斑点杂交方法敏感度和特异度强,适合在HRV大规模分子流行病学调查时应用.通过该方法的初步应用,发现北京地区婴幼儿HRV除了常见的G1、G2和G3型外,还有G9型感染.