MicroRNA-101真核表达载体的构建及其在人胎盘绒毛癌中的表达

摘要

目的:研究外源性microRNA-101前体的真核表达载体构建方法和其在人胎盘绒毛癌细胞JAR中的表达,及其对靶基因EZH2的沉默作用.方法 :利用化学合成法合成microRNA-101前体分子(pre-microRNA-101)并克隆至真核表达载体pRNAT-CMV3.2/Neo.通过酶切及测序法验证该阳性重组质粒pRNAT-CMV3.2-mir101的正确性.体外培养人胎盘绒毛癌细胞JAR;利用脂质体转染法将空白质粒及重组子pRNAT-CMV3.2-mir101转染至JAR细胞.应用Northern blotting检测各组细胞之间成熟microRNA-101(mature microRNA-101)的表达情况;应用Western blotting检测各组细胞中JAR的表达情况.结果: 质粒酶切及测序结果显示pRNAT-CMV3.2-mir101上的microRNA-101与合成的pre-microRNA-101寡核苷酸序列完全一致,无碱基的突变和缺失.Northern blotting结果显示,pRNAT-CMV3.2-mir101转染组细胞的总RNA中含有microRNA-101阳性条带,说明该细胞中mature microRNA-101呈高水平表达.Western blotting结果表明,pRNAT-CMV3.2-mir101转染组JAR细胞中的EZH2蛋白表达量(52.76±3.12)%低于对照组(81.18±2.96)%,两者具有显著差异(P<0.05).结论: 通过构建真核细胞表达质粒可以高效表达外源性microRNA分子;microRNA-101可以有效地沉默宿主细胞JAR中靶基因EZH2的表达.