ALR siRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建

摘要

目的 筛选并构建肝再生增强因子(ALR)基因的最佳RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,为研究ALR 基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据.方法 针对ALR基因序列设计并合成4个siRNA靶点,酶切连接GV118-GFP载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定;在包含ALR基因的质粒中以PCR法扩增出A勰基因,克隆至慢病毒载体GV143,构建ALR基因的过表达质粒,将RNAi重组慢病毒载体和ALR的基因表达质粒共转染293T细胞,用western blot检测其对目的基因ALR的敲减效率.结果 酶切鉴定证实成功构建了ALR RNAi慢病毒载体及ALR基因过表达载体.不同浓度干扰质粒(0.4 μg和0.8μg)的western blot结果显示,相较于阴性对照组,KD1组ALR蛋白的表达水平(0.51±0.02,0.36±0.09)、KD2组ALR蛋白的表达水平(0.65±0.04,0.49±0.02)、KD3组ALR蛋白的表达水平(0.62±0.07,0.52±0.02)均降低(P均＜0.05),而以KD1组蛋白表达量最低.结论 成功筛选并构建了能有效沉默ALR基因的最佳RNAi重组慢病毒载体,为后续实验奠定基础.