运用穿梭质粒在小鼠沙眼衣原体中表达外源性基因

摘要

目的在能够转化小鼠沙眼衣原体的穿梭质粒pGFP::CM中加入新的开放读码框,为研究衣原体单个蛋白功能奠定基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增质粒pGFP::CM和新的开放读码框（包括质粒蛋白pgp4的启动子、红色荧光蛋白mCherry基因和沙眼衣原体CT579的转录终止序列）,将连接产物转化至大肠埃希菌感受态Stellar中,提取质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将重组质粒利用氯化钙法转化至无质粒的CMUT3中,荧光显微镜下观察并挑选带有荧光的转化衣原体包涵体,经过氨苄西林筛选和噬菌斑纯化后,采用间接免疫荧光染色法检测转化株CMUT3-pGFP-mCherry-CM中pgp3和glgA蛋白的表达。结果经PCR、酶切和测序鉴定后得到正确序列的重组质粒,转化CMUT3后可见含有绿色和红色荧光的衣原体包涵体。氨苄西林筛选和噬菌斑实验纯化后得到新的转化株CMUT3-pGFP-mCherry-CM。免疫荧光证实pgp3和glgA蛋白在衣原体CMUT3-pGFP-mCherry-CM和CMUT3-pGFP::CM中表达相似。结论在质粒pGFP::CM中成功加入开放读码框,转化衣原体后能够表达外源性基因,使衣原体转化技术能够用于衣原体蛋白质功能研究,为临床沙眼衣原体感染的防治提供新的线索。