HIF-1α过表达慢病毒载体的构建及对心肌细胞Notch配体Jagged1表达的影响

摘要

目的 构建低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)过表达重组慢病毒质粒并包装病毒,将病毒感染乳鼠心肌细胞,分析其对Notch配体Jagged1表达的影响.方法 从cDNA文库中PCR扩增人HIF-1α编码序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV218,转化感受态大肠杆菌细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定.将HIF-1α过表达慢病毒质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装出慢病毒颗粒.原代分离SD乳大鼠心肌细胞,将HIF-1α过表达慢病毒感染心肌细胞,定量PCR分析Jagged1 mRNA水平的变化.结果 成功扩增HIF-1α编码序列并正确连接入线性化载体GV218,获得阳性转化子并测序无误.将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为1×108 TU/ml的慢病毒颗粒,Westernblot法检测到HIF-1 α-GFP融合蛋白.重组慢病毒感染乳鼠心肌细胞后,胞核中见GFP信号.与对照组相比,HIF-1 α过表达5天后显著上调Jagged1 mRNA的水平.结论 心肌细胞中HIF-1α可诱导Jagged1的表达.HIF-1 α过表达重组慢病毒载体的成功构建,为研究缺血缺氧性心肌损伤反应的分子机制奠定了基础.