沉默dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞周期、增殖及凋亡的影响

摘要

背景与目的:DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferase1,dnmt1)基因在多种肿瘤细胞中表达量相当高,而在正常成人细胞中则低表达,因此dnmt1基因的高表达与肿瘤的发生有密切的关系。本研究观察以dnmt1基因为靶基因的重组质粒对胃癌细胞株AGS细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法:设计短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的寡核苷酸片段,再克隆至载体pTZU6+1中构建重组体pshRNA-dnmt1,转染胃癌细胞株AGS。实验分为空白对照组(仅予脂质体)、pTZU6+1组(予空质粒pTZU6+1)和pshRNA-dnmt1组(予以重组质粒pshRNA-dnmt1)3组。Westernblot检测dnmt1蛋白水平变化;RT-PCR法评估mRNA水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;吖啶橙/溴乙锭双染色(AO/EB)法、电镜和TUNEL观察细胞凋亡情况。结果:成功构建重组质粒pshRNA-dnmt1,并经序列分析得到确认。pshRNA-dnmt1转染AGS细胞后24h出现dnmt1蛋白表达量减少,24、48、72h抑制率分别为28.24%、68.54%、81.47%。转染pshRNA-dnmt1后24、48、72h对AGS细胞中dnmt1mRNA的抑制率分别为21.63%、52.97%、72.06%。转染后72hS期细胞由空白对照组的(36.58±1.76)%降至pshRNA-dnmt1组的(18.54±6.59)%;G2/M期细胞由空白对照组的(6.18±0.32)%升至pshRNA-dnmt1组的(18.53±1.42)%,均有显著性差异(P<0.05)。转染后24、48、72h细胞存活率分别为79.49%、51.63%和39.16%。AO/EB法、电镜和TUNEL均可见大量典型的凋亡和坏死细胞。结论:重组质粒pshRNA-dnmt1能特异有效地抑制AGS细胞内dnmt1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供依据。