用于靶向于NFAT的免疫抑制类小分子化合物筛选的细胞模型的建立

摘要

建立IL-2启动子以及NFAT-AP1增强子调控报告基因包括d2EGFP或Lueiferase在Jurkat细胞中瞬时表达的细胞模型.首先,利用三步连接将IL-2 promoter-255～+285处的序列插入到pNF-κB-d2EGFP表达载体启动子上游,形成3个拷贝的前后串联的增强子序列;然后从人外周血钓取两条IL-2 promoter序列,包括-326～+46以及-89～+46两段基因组序列,分别替代上述重组表达载体中的TK minimal promoter,构建所需的IL-2 promoter以及NFAT-AP1 enhancer调控的报告基因表达质粒:3×NFAT-AP1-IL-2P/d2EGFP和3×NFAT-AP1-TATA/d2EGFP;最后,分别将3×NFAT-AP1-IL-2P以及3×NFAT-AP1-TATA融合基因克隆到pGL3-basic载体中,构建相应的Luciferase报告基因表达质粒.利用电转染方法将重组的报告基因表达载体瞬时转入Jurkat细胞后发现,未刺激以及PMA、离子霉素(Ionomycin)单刺激均不能激活下游报告基因的表达,只有PMA和离子霉素联合刺激才能启动d2EGFP以及Luciferase的转录表达,并且5μg/mL FK506预先作用1h能几乎完全阻断刺激剂诱导的无论是IL-2promoter还是NFAT-AP1 enhancer调控的报告基因的表达.实验结果提示,所构建的Jurkat细胞瞬时表达模型可用于靶向于NFAT信号通路的FK506类免疫抑制小分子化合物的初步筛选.