用于小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

摘要

随着分子生物学技术与生物信息学技术的迅速发展和学科融合，基于生物大分子功能域的药物设计加快了有机小分子化合物成为更具有靶向、特异、高效、稳定性治疗性药物的速度。但如何快速、准确地筛选出特异性作用于生物大分子靶功能域的小分子化合物并验证它们所介导的生物效应，是有机小分子化合物作为新药研制中所急待解决的关键问题。因此，建立高效和特异的用于小分子药物筛选的细胞模型对于靶向特异新药的研制及它们所介导的生物效应机理探讨有着重要的意义。本研究基于FK506的促神经再生和免疫抑制功能域的晶体结构的生物信息数据及免疫分子CD4的功能结构域的晶体结构及其所介导免疫应答效应，应用分子生物学、细胞生物学等方法建立并验证了靶向FKBP12、NFAT信号通路以及CD4二聚化位点D1或D4结构域的高通量药物筛选的细胞模型，并对靶向于FKBP12的FK506类促神经再生小分子化合物以及靶向于CD4D1结构域的CD4拮抗类小分子化合物进行了初步筛选和探索。本研究主要分为两大部分。 一、用于FK506类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定1靶向FKBP12的FK506类促损伤神经再生小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定 利用RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因，插入PUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中，构建pC4FV1E/BAX表达质粒。将表达质粒与pCDNA3.1共转染HEK293细胞，建立pC4FV1E/BAX-neo、和neo基因稳定表达的细胞模型。利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12/BAX双聚介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析。分别利用RT-PCR以及Western-blotting方法从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达；阳性化合物AP20187作用4-6hr后，Giemsa染色可见明显的凋亡小体；钙依赖核酸内切酶亦被激活，出现典型的“DNALadder”；天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡。上述结果表明，所构建的FKBP12/BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型，可以用于FK506类促损伤神经再生小分子化合药物的高通量筛选。 2靶向NFAT信号通路的FK506或CsA类免疫抑制小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定首先，利用三步连接将IL-2promoter-255--285处的序列插入到pNF-κB-d2EGFP表达载体启动子上游，形成三个拷贝的前后串联的增强子序列；然后从人外周血钓取两条IL-2promoter序列，包括-326-+46以及-89-+46两段基因组序列，分别替代上述重组表达载体中的HSV-TKminimalpromoter,构建所需的IL-2promoter以及NFAT-AP1enhancer调控的报告基因表达质粒：3×NFAT-AP1-IL-2P/d2EGFP和3×NFAT-AP1-TATA/d2EGFP；最后，分别将3×NFAT-AP1-IL-2P以及3×NFAT-AP1-TATA融合基因克隆到pGL3-basic载体中，构建相应的Luciferase报告基因表达质粒。利用电转染方法将重组的报告基因表达载体瞬时转入Jurkat细胞后发现，未刺激以及PMA、Ionomycin单刺激均不能激活下游报告基因的表达，只有P+I联合刺激才能启动d2EGFP以及Luciferase的转录表达，并且5ug/mlFK506预先作用1hr能几乎完全阻断刺激剂诱导的无论是IL-2promoter还是NFAT-AP1enhancer调控的报告基因的表达。结果显示，所构建的Jurkat细胞瞬时表达模型可用于靶向于NFAT信号通路的FK506类免疫抑制小分子化合物的初步筛选。 二、用于CD4拮抗类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定1基于CD4以及MHC-Ⅱ类分子之间相互作用的细胞黏附模型的建立与鉴定利用RT-PCR扩增人源性CD4胞浆缺陷型基因，克隆进绿色荧光表达载体pEGFP-N1中。将pEGFP-N1/CD4转染HEK293细胞，G418筛选稳定克隆。分别利用RT-PCR、Western-blotting方法从mRNA及蛋白水平检测到细胞中CD4分子的整合及表达；激光共聚焦显微镜观察到CD4分子于细胞核外周尤其是胞膜分布。HEK293/CD4稳定细胞克隆与Raji细胞孵育1hr后，可见玫瑰花环的形成(Rossetformation)，而CD4抗体能够明显抑制这种玫瑰花环的形成。结果提示，这种基于CD4分子和MHC-Ⅱ类分子相互作用的细胞黏附模型的建立，为CD4拮抗类肽分子和非肽类小分子化合物的筛选提供了一个可应用的技术平台。 2DOX调控CD4表达诱导细胞凋亡模型的建立(1)CD4同源二聚化或寡聚化的间接检测及其介导的生物学功能的初步分析近年来的研究表明，CD4分子于细胞膜表面不仅以单体形式存在还可以通过其D4和D1形成同源二聚化及寡聚化，并且二聚化及寡聚化的CD4分子才能稳定地与MHC-Ⅱ类分子结合。本文通过分析CD4分子以及CD4缺失突变体分子融合Fas基因片段所诱导的转染靶细胞的凋亡，以及携带绿色荧光蛋白的CD4分子转染HEK293细胞所筛选出的稳定克隆的不同荧光强度和与MHC-Ⅱ类分子阳性细胞Raji之间的不同黏附效应间接鉴定CD4同源二聚体或寡聚体的存在，并对二聚化或寡聚化CD4分子所介导的生物学功能进行初步分析。 (2)靶向CD4二聚化位点的CD4拮抗类新型免疫抑制剂筛选的细胞模型的建立建立HEK293/Tet-on稳定表达的细胞株，利用四环素衍生物-强力霉素(DOX)调控目的基因在此细胞株中的表达。首先，将pTet-on质粒转染进HEK293细胞，通过G418(400ug/ml)筛选得到50个稳定表达的细胞克隆。接下来利用四环素调控系统应答质粒pBI-EGFP从这50个克隆中筛选出2个低背景、高诱导性的细胞株。最后利用DOX调控外源基因包括CD4、CD4-Fas、D1D2-Fas、D3D4-Fas以及Fas胞浆区基因融合GFP在这两个细胞克隆中瞬时表达。结果显示，CD4经诱导后表达明显增强；Fas胞浆区DD(deathdomain)基因诱导前对细胞无影响，诱导后能导致转染的部分细胞变圆死亡，细胞凋亡率为18.81％；而CD4-Fas、D1D2-Fas以及D3D4-Fas融合基因经DOX诱导表达后能介导转染的较大部分细胞死亡，细胞凋亡率分别为26.43％、29.10％以及27.58％，较前者而言，凋亡率增加了近9％。因此，实验结果提示，各CD4分子包括CD4胞浆缺陷型分子以及结构域缺失突变体分子D1D2和D3D4能够通过其自身的相互作用介导下游融合的FasDD蛋白的聚集，从而激活后者依赖的信号途径导致转染靶细胞的凋亡。所构建的这种DOX调控CD4重组蛋白表达诱导细胞发生凋亡的模型可能为将来针对CD4二聚化或寡聚化位点—包括D1或D4结构域设计的CD4拮抗肽或小分子化合物的初筛提供一个可应用的平台。

目录

前言

第一部分用于FK506类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

(一)靶向FKBP12的FK506类促损伤神经再生小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

1材料和方法

2结果

3讨论

(二)靶向NFAT信号途径的FK506类免疫抑制小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

1材料和方法

2结果

3讨论

第二部分用于CD4拮抗类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

(一)基于CD4及MFHC-Ⅱ类分子之间相互作用的细胞黏附模型的建立与鉴定

1材料和方法

2结果

3讨论

(二)DOX调控CD4表达诱导细胞凋亡模型的建立

Ⅰ.CD4同源二聚化或寡聚化的间接检测及其介导的生物学功能的初步分析

Ⅱ.靶向CD4二聚化位点的CD4拮抗类小分子化合物筛选的细胞模型的建立

结论

参考文献

文献综述1 化学诱导二聚化模型FKBP12-CID的应用

致谢

附录Ⅰ缩写词表

附录Ⅱ