多聚精氨酸融合增强型绿色荧光蛋白制备方法及穿膜效果

摘要

为了方便细胞穿膜肽R9融合蛋白的可溶性表达及功能上的研究,构建了pSUMO(小分子泛素样修饰蛋白)-R9-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)原核表达载体.分别纯化EGFP及R9-EGFP蛋白后,作用于HepG2,细胞经流式细胞仪及激光共聚焦检测R9细胞穿膜肽的作用效果.实验结果显示在SUMO分子伴侣的作用下,R9-EGFP融合蛋白获得可溶性表达.经流式细胞仪检测,R9细胞穿膜肽可以快速有效的携带目的蛋白进入细胞内部且呈时间、剂量依赖性,大约1.5 h以后荧光强度进入平台期.共聚焦显微镜检测结果表明R9细胞穿膜肽可以有效携带EGFP进入HepG2细胞,并显示主要聚集在细胞浆内.同时体外经肝素抑制实验显示,肝素抑制R9-EGFP穿膜的效率达到50％.这些结果表明,可以利用pSUMO-R9/Ni-NTA表达纯化系统,快速、有效地表达出可溶性多聚精氨酸融合蛋白,同时R9细胞穿膜肽可以有效地携带目的蛋白进入细胞内,为进一步研究多聚精氨酸的穿膜机制提供了基础.