潮霉素B抗性为选择标记的整合型表达载体的构建及在米根霉中的遗传转化

摘要

为了建立适合米根霉的遗传转化体系,应用重叠延伸PCR的方法构建了以潮霉素B抗性为选择标记的单交换整合型表达载体pBS-hygro-ldhA;分别采用PEG/CaCl2介导的原生质体转化、原生质体电转化及萌发孢子电转化的方法将表达载体pBS-hygro-ldhA转化入米根霉AS 3.819菌株中,并研究了菌丝酶解时间、孢子萌发时间以及电转化电场强度对于转化效率的影响;通过荧光定量PCR (qPCR)对米根霉转化子基因组中质粒整合拷贝数进行了检测,并研究了其对米根霉转化子抗性稳定性的影响.实验结果表明成功获得整合了表达载体pBS-hygro-ldhA的米根霉转化子.菌丝酶解140 min产生的原生质体其再生率和转化率最高,原生质体电转化最佳电场强度为13 kV/cm,孢子萌发2.5 h转化率最高,萌发孢子电转化最佳电场强度为14 kV/cm.萌发孢子电转化方法转化率要高于原生质体转化的方法.荧光定量PCR检测结果表明,在一定范围内,高质粒整合拷贝数的米根霉转化子比较稳定.研究建立了用于工业米根霉菌株的遗传转化体系,为米根霉代谢调控研究以及菌种改造工作提供了基础与支持.