原生质体

摘要： 黑曲霉(Aspergillus niger)是食品工业中重要的生产菌株,广泛应用于酶和有机酸生产。为提高黑曲霉遗传操作效率,对黑曲霉转化及重组菌株筛选策略进行优化。基于已报道的最佳转化条件对黑曲霉AG11进行电转化、农杆菌介导和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化(Agrobacterium-mediated and PEG-mediated transformation,PMT),单个潮霉素转化板分别得到0、30和6个转化子。其中,PMT的转化子阳性率最高。基于优化后的原生质体制备条件:0.8~1 g松散的菌丝球于10 mL Yatalase溶液(0.8 mg/mL,pH 5.5)反应2.5 h,获得原生质体并进行PMT,转化效率较优化前提高14倍。为提高转化子筛选效率,将融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的天冬酰胺酶(asparaginase,ASN)基因整合至黑曲霉AG11糖化酶位点,并通过流式细胞仪分选表达ASN的孢子。分选结果显示,0.3%的孢子能表达GFP(共筛选30万个孢子)。酶活力分析表明,65%表达GFP的孢子能表达ASN。研究结果将为黑曲霉基因编辑提供重要方法学基础。

摘要： 为探讨斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)交配型位点结构及其多态性,通过制备双核菌株H3、X3和B3的原生质体及再生获得其单核菌株,分别命名为H3-1、X3-1、B3-1,其他按顺序编号;H3-1、X3-1、B3-1分别与同一菌株的其他单核菌株两两配对,各选取1对亲和单核菌株,两两配对测定交配型,采用生物信息学分析比较基因组重测序后不同单核菌株的A和B交配型位点结构及其多态性。结果表明:双核菌株H3、X3、B3分别分离得到2、13、5对亲和单核菌株,各选取的1对亲和单核菌株两两配对,确定6个单核菌株H3-1、H3-8、X3-1、X3-13、B3-1、B3-2的交配型分别为A1B1、A2B2、A1B3、A3B1、A4B1、A5B4;6个单核菌株的A交配型位点两翼紧邻MIP和B-fg保守基因,且HD2.2结构域共线性良好,单核菌株H3-8和B3-1的A交配型位点结构完全相同,6个单核菌株共包括5种A交配型位点结构,表明A交配型位点具有丰富的多态性;单核菌株X3-1包含5个信息素受体,单核菌株X3-13、H3-1、B3-2均包含7个信息素受体,单核菌株H3-8、B3-1均包含6个信息素受体,6个单核菌株B交配型位点共包括4种,单核菌株H3-1、X3-13、B3-1、H3-8、B3-2均包含1个信息素前体,单核菌株X3-1包含2个信息素前体,B交配型位点结构上下游基因的共线性较差,表明B交配型位点具有丰富的多态性。

摘要： 为探明适宜的舞春花原生质体分离条件,对其外植体预处理方式、酶液组合、渗透压、酶解时间等进行了研究。结果表明,适宜的舞春花叶肉原生质体分离条件为4°C黑暗预处理24 h,用0.2%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8%离析酶+0.25 mol/L甘露醇+20 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+0.1%牛血清白蛋白(BSA)+0.11%CaCl2的酶液酶解5 h,在此分离条件下,舞春花原生质体产量为5.62×10^(6)个/g、活力为87.13%。

摘要： 土壤修复是“十四五”期间国家重点支持的环保领域,是实现社会可持续发展的重要保障。与其他方法相比,植物修复技术整体优势突出,对于土壤重金属的去除净化更为有效。原生质体是植物细胞代谢活动的重要场所,相对于细胞壁而言,原生质体对重金属胁迫的生理响应同样强烈。现阶段,同类植物修复机制研究多从分子生物学层面切入;本研究则从谱学角度展开,初步探究植物原生质体对土壤重金属的反馈信号。以代表性的菊科植物金盏菊为研究对象,通过Pb/Cd胁迫盆栽实验获取金盏菊样本,差速冷冻离心法得到金盏菊原生质体。引入Tessier连续提取-原子吸收光谱法(AAS)揭示胁迫强度与Pb/Cd赋存形态的内在关联,结合X射线衍射光谱(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、二维相关红外光谱(2D-IR)和X射线光电子能谱(XPS)识别金盏菊原生质体对Pb/Cd响应的谱学表现。结果表明:金盏菊原生质体可交换态Pb/Cd比例不高,胁迫强度对不同形态Cd含量影响很小。XRD图谱最强信号出现在31.7°(NaCl晶体),同时检测出Pb盐[Pb_(5)(PO_(4))_(3)Cl]和Cd盐(CdS)特征峰。FTIR图谱的3510 cm^(-1)附近强吸收带源于—OH伸缩振动,胁迫过程导致峰形杂乱、峰位偏移;2D-IR结果说明Pb/Cd优先与金盏菊原生质体—OH和C O结合。从XPS图谱可以看出,反应前后原生质体C,O元素结合能有异。C(1 s)结合能略有增加,说明C原子参与了配位反应;O(1 s)峰位有所偏转,暗示含O基团对Pb/Cd的结合包含多种途径。新出现的Pb(4 f)峰源于π电子-Pb的交互作用;胁迫浓度增加导致Cd(3 d)结合能升高,表明Cd具有明显失电子倾向。相关结果可以与前期获得的Pb/Cd/金盏菊细胞壁结合特性互为补充,对于完善同领域的深度和广度、构建植物修复理论和技术体系意义重大。

摘要： 为了优化和筛选谷子中高效的CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9)基因编辑系统,针对谷子八氢番茄红素脱氢酶基因(SiPDS)设计6种gRNA(gRNA1—gRNA2针对外显子1,gRNA3—gRNA6针对外显子12),构建多种CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过聚乙二醇(PEG)介导的方法转入谷子原生质体中,然后利用开发的大规模平行测序技术快速检测它们对SiPDS的突变效率。结果表明,采用7 d谷子黄化苗幼茎建立的原生质体转化系统的转化效率较高,为50.44%~57.36%。将Super启动子(SP)、谷子内源的泛素启动子(Ubi)分别驱动Cas9基因的基因编辑系统转入谷子原生质体中,发现两者对SiPDS基因的突变效率分别为0.5%、5.5%。随后采用Ubi启动子驱动Cas9基因,比较单一gRNA、双gRNA和tRNA结构的基因编辑系统对SiPDS基因的突变效率,发现双gRNA基因编辑系统Ubi-dgRNAE1和Ubi-dgRNAE12的突变效率分别较单一gRNA基因编辑系统提高了1.66倍和1.11倍;tRNA基因编辑系统Ubi-tRNA的突变效率较单一gRNA基因编辑系统提高了5.87倍,为51.24%,且Ubi-tRNA可同时针对多个位点进行编辑,其多位点突变频率为3.23%。比较gRNA3、gRNA4、gRNA5体外转录产物分别与Cas9蛋白混合制成的核糖核蛋白(RNP)复合物的体外切割活性,发现RNP-gRNA5复合物体外切割活性最高,其对SiPDS基因的突变效率是2.0%,并且引起的突变类型主要为小于3 bp的缺失。

摘要： 以番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)CS12菌株为研究对象,从菌龄、酶种类与浓度、酶组合、酶解温度与时间、不同渗透压稳定剂等方面对番茄匍柄霉原生质体制备条件进行了优化,并筛选了最适再生培养基,成功建立番茄匍柄霉原生质体制备与再生体系。番茄匍柄霉CS12在菌龄为36 h,稳渗剂为0.7 mol·L^(-1) NaCl溶液,酶解液为10 mg·mL^(-1) Kitalase裂解酶,28°C酶解3.5 h的条件下制备的原生质体效果好,在YEPS再生培养基上再生效率最高。番茄匍柄霉原生质体制备与再生体系的建立,为进一步研究番茄匍柄霉致病机理与功能基因组学奠定了基础。

摘要： 以胁迫温度和胁迫时间为参数设置梯度胁迫条件,对菌株灰树花2#原生质体进行高温胁迫,研究高温致死胁迫条件,分析不同胁迫条件下再生菌株的胞外酶活性。结果表明,灰树花2#原生质体高温胁迫的最适温度为48°C,对原生质体致死发生响应的最短时间为0.5 min,使原生质体全部致死的最长时间为7.5 min,胁迫条件为48°C、0.5 min~7.5 min。不同高温胁迫条件下的再生菌株之间、再生菌株与出发菌株之间的胞外酶活性存在个体差异。再生菌株T_(48)M_(7)-1、T_(48)M_(5)-19和T_(48)M_(3)-36的羧甲基纤维素酶活性及漆酶活性极显著高于出发菌株灰树花2#(P<0.01)。再生菌株T_(48)M_(7)-1的羧甲基纤维素酶活性及固体培养基漆酶活性显著高于T_(48)M_(5)-19和T_(48)M_(3)-36菌株(P<0.05)。研究结果可为灰树花及其他食用菌原生质体育种技术提供科学参考。

摘要： 本文从原生质体的获取、纯化、计数、培养、分裂和遗传改造等六个方面,深入解读了近几年浙江选考题中涉及原生质体的疑难问题,以期提高师生对原生质体相关应用知识的理解。

摘要： 细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata var.liui Zhang et Xia)俗称细江蓠(Gracilaria crinale),是我国沿海地区主要养殖的大型海洋经济藻类之一。为获得细基江蓠繁枝变种原生质体制备的最佳酶解条件,本研究以酶解液组分、酶解温度和酶解时间等因素对细基江蓠繁枝变种原生质体分离纯化的实验条件进行优化,最终得出最佳酶解条件为:1)酶解液组分:盐度为25的灭菌天然海水中加入10 mmol/L CaCl_(2)、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.5%果胶酶Y-23、10 U/mL琼脂糖酶,pH 6.3;2)酶解条件:28°C、80 r/min、黑暗酶解8 h。

摘要： 【目的】木质部细胞壁的组成及特性是决定材性的重要因素,研究木质部细胞壁形成的分子调控机制对于木材改良具有重要意义。本研究探究了白桦木质部原生质体初生壁再生过程的分子调控机制,并鉴定出重要调控基因,旨在为林木材性性状研究提供数据和材料。【方法】分别以培养0 h和2 h的白桦木质部原生质体为材料,通过荧光增白剂染色观察初生壁再生过程。利用转录组分析技术研究初生壁再生前后的差异表达基因及其参与的调控途径,将检测到的差异表达基因在GO、KEGG、PlantTFDB数据库中进行比对分析。【结果】荧光显微镜观察结果显示:原生质体分离后不具有细胞壁,培养2 h再生初生细胞壁。以|log2(FC)|≥1(FC为差异倍数)且q<0.05为标准筛选差异基因,结果显示:相较于刚分离的原生质体,培养2 h的原生质体中检测到4396个上调表达的基因,4056个下调表达基因,总计8452个差异表达基因。其中GO数据库共注释到10个显著上调条目,KEGG数据库注释到10个显著差异代谢通路,PlantTFDB数据库共注释到16个家族的360个差异表达转录因子。GO注释结果表明,DNA复制、细胞周期相关基因上调表达。KEGG注释结果表明,谷胱甘肽、α-亚麻酸等与抗逆代谢相关的基因下调表达,果胶脂酶相关基因上调表达。PlantTFDB注释结果表明,bHLH、NAC、MYB、bZIP等与细胞壁合成密切相关的转录因子均差异表达。【结论】培养2 h的木质部原生质体处于细胞壁再生及分裂准备状态,DNA复制、细胞周期、多糖合成代谢等相关基因在白桦木质部原生质体培养及初生细胞壁形成过程中起调控作用。

摘要： 以东方百合'索邦'的叶片和花瓣为材料,分析了高渗溶液处理和黑暗处理对百合原生质体制备的影响,并利用正交试验优化原生质体制备的参数,探讨不同酶浓度、酶解时间、取材部位等因素对原生质体产量的影响.结果表明,13％的甘露醇处理30min以及黑暗处理叶片48h、黑暗处理花瓣72h均可显著提升原生质体产量.叶片在2％纤维素酶、1％离析酶、酶解时间7h、取上部新叶时酶解效果最好,花瓣在2％纤维素酶、0.5％离析酶、酶解时间10h、取初开期的花被片时原生质体产量最高.

摘要： 马铃薯原生质体培养与再生技术体系是细胞融合、遗传转化和基因编辑育种的平台技术.对影响马铃薯原生质体培养和再生技术以及原生质体培养技术体系在马铃薯上的应用进行了综述,针对马铃薯原生质体再生技术存在的问题与相应对策进行了讨论，指出未来有必要针对不同马铃薯品种(系)分别开展马铃薯原生质体培养技术的研究。加强马铃薯原生质体细胞的分化等再生相关机制研究，同时加强对再生植株体细胞变异的细胞遗传学研究。加强马铃薯原生质体融合技术的遗传改良研究和基因编辑技术研究。

摘要： 以牧草菊苣品种‘SIXPOINT’种子无菌苗的叶片为起始材料进行了叶肉原生质体分离、培养和植株分化的研究,建立了高频率的植株再生系统.利用10mL酶解液处理鲜叶10～15h,从1g鲜重叶片分离出(4.0～4.5)×106个原生质体,存活率达75％～86％.原生质体分别用两种培养基进行了培养,结果表明:最适合培养基为改良KMP,原生质体的分裂率和植板率分别达到35.2％和16.5％.利用不同的培养方式对原生质体培养的影响进行了比较,包埋培养获得的原生质体分裂率(41.5％)和植板率(22.6％)都优于液体培养.同时对原生质体培养的时间长度与愈伤组织的胚胎发生能力及植株分化频率进行了测试和分析,原生质体培养4～5周为最佳时间,愈伤组织的胚性(78.5％)和分化率(59.6％)最高;当培养时间达到6～7周,胚性愈伤及植株分化的比例分别为51.4％和43.6％;当培养时间达到8～9周,原生质体形成的胚性愈伤频率和植株分化率均出现大幅度下降.原生质体的再生植株在不含激素1/2MS培养基上,部分植株很快地直接生根,未生根的植株再转至1/2MS+IBA0.3mg·L-1+0.1％活性炭可以诱导生根.

摘要： 目的：探索药用植物雷公藤悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系. 方法：以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度、处理转速等因素进行考察.用PEG介导瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中. 结果：雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是：酶液配比为2.0％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.5％离析酶,甘露醇浓度0.6mol/L,酶解时间10h,处理转速67×g;PEG介导含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光. 结论：筛选得到了雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学等研究奠定了基础.

摘要： 原生质体融合是现代细胞工程中常用的技术,经过融合,不同原生质体的遗传物质会整合到一起,从而得到所需的具有特定遗传特性的细胞.获得原生质体是进行融合的关键步骤.本试验研究了酶解法制备酵母原生质体过程中酵母细胞破壁的最优条件.结果显示,用STC重悬OD600=2的酵母菌数量在30min可取得较好去膜效果的最佳条件为反应温度为37°C,酶量为40μg/mL.

摘要： 安丝菌素(Ansamitocin)是能从橙色束丝放线菌(Actinosynnema mirum)发酵液中分离的安莎类产物,具有显著抗肿瘤作用,因其细胞毒性较强,将其与单克隆抗体连接成抗体靶向药物,用于肿瘤治疗.根据安丝菌素C-3侧链的碳链长度不同,有二十多种衍生物,如:P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4,其中AnsamitocinP-3(AP-3)的产量最高,活性最强.然而，当前安丝菌素发酵产量极低，通过高产菌株选育和发酵工艺优化仍是提高产量的关键。本文以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565为出发菌株，利用原生质体制备与再生技术，结合活性产物快速筛选模型，选育高产菌株，并对获得的突变株进一步进行培养基优化、发酵流加工艺优化。首先，采用抑菌活性、薄层层析法(TLC)对突变株发酵液中AP-3进行了定性和半定量检测，建立简便高效率的半定量检测方法。初筛获得少量高产菌株再通过超高效液相色谱(UPLC)复筛定量检测，结果获得P-102,P114,P-127,P-133等四株高产菌株，其中P-102菌株的产量达48.74μg/ml，比原始菌株提高了3.6倍。

摘要： 蛹虫草又称北冬虫夏草,是重要的药食用真菌,已有研究表明其主要活性成分具有与野生冬虫夏草极同的药理作用,甚至某些活性成分含量还高于冬虫夏草,可作为冬虫夏草的代替品.自蛹虫草的无性型分离以来,人们对蛹虫草无性型的液体发酵条件、菌丝体有效成分、活性物质的分离纯化及部分生理功能等进行了广泛的研究,蛹虫草无性型菌丝体含有与有性型子实体相似的生理活性物质及药用价值,可利用发酵生产蛹虫草无性型菌丝体来进行相关产品的开发.然而由于蛹虫草分布比较广泛,不同产地、不同寄主的蛹虫草的生长条件、活性成分种类以及相对含量等也有不同,其无性型—蛹草拟青霉的液体发酵条件、活性物质种类及含量也存在较大差别.在野生虫草资源日益匮乏的情况下,研究开发人工虫草,选育优良虫草菌株,探讨液体发酵条件、研究菌丝体活性成分、含量及生理功能对进一步利用和开发虫草资源具有重要的理论意义和深远的现实意义.rn 本研究以提高蛹虫草无性型深层发酵的菌丝体中腺苷含量为目标，以分离自长白山的一株蛹草拟青霉为出发菌株，在优化原生质体的形成和再生条件的基础上，以原生质体诱变的方法选育高产腺苷的蛹草拟青霉菌株。rn 以培养5d菌龄的菌丝体为基体，用1.0%纤维素酶和1.0%蜗牛酶作为复合酶，选择0.6mo1/L蔗糖为最佳的渗透压稳定剂，最佳酶解pH为6.3-6.5温度23°C，40rpm条件下，酶解3.5h，原生质体的制备率可达1.5x108个/ml，再生率为1.3%。制备的原生质体经紫外线诱变、微孔板初筛及摇瓶复筛，获得了一株的高产腺苷蛹草拟青霉菌株FY1421，经单因素及多因素的培养基及培养条件的综合优化，30L发酵罐中，其生物量(菌体干重)较出发菌株提高了26.5%,菌丝体中腺苷含量5480ug/g干重，较出发菌株提高9.36%，达到选育目标，也为进一步开发利用蛹虫草资源奠定了基础。

摘要： 本研究对聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)的分子量、浓度及处理时间等三个影响番木瓜叶肉原生质体转化效率的主要因素进行了优化,同时利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达体系进行了转化表达分析.结果表明:经40％PEG8000溶液处理10min,可使GFP在原生质体中的平均转化率达到45.26％;沉默抑制载体pGreen-Hcpro和GFP瞬时表达载体共转化番木瓜叶肉原生质体,可使GFP在原生质体中的平均转化率进一步提高到68.75％,相比单独转化瞬时表达载体pRNAi-GFP增长了51.90％.PEG介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立为番木瓜功能基因组和基因功能研究奠定了基础,可为热带作物的研究提供又一模式作物,推动热带作物在分子及细胞生物学领域的发展.

摘要： 发酵红曲是以大米为原料,使用从传统红曲中分离、纯化、筛选出的高发酵力菌株,采用发酵工艺技术制成的应用于红曲黄酒、红曲醋等产品的发酵生产的糖化发酵剂.酯化红曲是以小麦麸、小麦等粮谷为原料,接种从传统红曲中筛选、纯化分离出的高酯化力红曲菌株,采用发酵技术制成的糖化发酵剂.

摘要： 发酵红曲是以大米为原料,使用从传统红曲中分离、纯化、筛选出的高发酵力菌株,采用发酵工艺技术制成的应用于红曲黄酒、红曲醋等产品的发酵生产的糖化发酵剂.酯化红曲是以小麦麸、小麦等粮谷为原料,接种从传统红曲中筛选、纯化分离出的高酯化力红曲菌株,采用发酵技术制成的糖化发酵剂.

摘要： 本发明提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl2，pH为5.6；所述SCW液包括山梨醇、CaCl2和MES，所述SCW液的pH为5.8；向酶解产物中的上清液中加入W5溶液，离心取沉淀，向所述沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心取原生质体沉淀，再向其中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。本发明克服了提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的缺点，并且该方法融合效率比较高，原生质体仍能保持较高的细胞活性。

摘要： 本发明属于丝状真菌的工程细胞的制备技术领域，具体涉及一种茶树菇原生质体的制备方法及原生质体单核体菌株的制备方法。本发明提供了一种茶树菇原生质体的制备方法，本发明制备得到的茶树菇原生质体得率高、制备时间短，将所述茶树菇原生质体悬浮液涂布于再生培养基平板上获得茶树菇原生质体单核体菌株，茶树菇原生质体单核化率高，经单核体菌株对峙培养后，获得两种原生质体单核体菌株交配型；测定茶树菇原生质体单核体菌株交配型为开展茶树菇的杂交育种、融合育种、诱变育种、遗传转化和功能基因挖掘等奠定基础。

摘要： 本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用。每升本发明所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3％～2％W/V混合酶液，300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mMDTT和10～20mM MES；所述混合酶液包括纤维素酶R‑10和果胶酶Y‑23。利用本发明猕猴桃原生质体提取液对猕猴桃果肉进行酶解，能够缩短酶解时间，使制备的原生质体保持长时间的活力，增大提取效率。

摘要： 本发明公开了一种制备异叶水蓑衣原生质体的酶解液、异叶水蓑衣原生质体的制备及瞬时转化方法，涉及植物生物技术领域。其中，所述酶解液包括0.5‑4％纤维素酶、0.1‑1.2％离析酶、0.2‑1.0M D‑甘露醇、10‑30mM且pH为4‑7的吗啉乙磺酸、5‑15mM CaCl2、和0.05‑0.15％BSA。采用上述酶解液制备的原生质体及原生质体瞬时转化，可运用于检测转基因的表达效果、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、亚细胞定位、基因相互作用等，通常在瞬时表达载体上插入可以在特定荧光下观察的蛋白质的基因，方便目的基因的识别，多用于快速、高效的检测方法。

摘要： 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法。本发明的小麦原生质体制备方法包括以下步骤：培养小麦种子；剪取三叶期的小麦苗叶片，利用酶解液酶解；固液分离，得到小麦原生质体。本发明建立了小麦原生质体制备及转化体系，方法简单、有效，可以用于小麦蛋白亚细胞定位，小麦蛋白互作和蛋白纯化以及荧光素酶标记的基因表达等方面的研究。

摘要： 本发明公开了一种花椒原生质体培养再生植株的方法，将来源于花椒无菌试管苗叶片的原生质体悬浮于原生质体培养基中，调整密度后经液体浅层静置培养形成细胞团和小愈伤组织；愈伤组织经增殖培养后，接种到分化培养基上培养分化出不定芽，再转接到生根培养基上培养形成完整植株。本发明对花椒原生质体培养过程中的重要环节进行了深入的研究，尤其是摸索出了专用的原生质体培养基，大大提高了原生质体的细胞分裂频率以及细胞团形成频率。本发明成功获得了原生质体再生植株，初步建立了完整的花椒原生质体再生体系，对开展花椒体细胞杂交育种、原生质体遗传转化等相关生物技术研究具有重要意义。

摘要： 本发明提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl

摘要： 本发明公开了一种高粱原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法，包括以下步骤：(1)取高粱种子于水中催芽，并将芽播种、培育成黄化苗；(2)剪取生长良好的高粱黄化苗，用甘露醇预处理后，取中间的叶鞘部分，用刀片切成细条；(3)对切好的叶鞘用原生质体酶解液进行酶解处理，裂解高粱原生质体；(4)对裂解的高粱原生质体进行固液分离，即得高粱原生质体；本发明首次建立了高粱原生质体制备及转化体系，其方法简单、有效，可以用于高粱蛋白亚细胞定位，高粱蛋白互作和蛋白纯化以及荧光素酶标记的基因表达等方面的研究。

摘要： 本发明公开了一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体，涉及丝状真菌的工程细胞的制备技术领域。本发明提供的食用菌原生质体的制备方法包括：将食用菌菌种接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，得到长有菌丝的菌落；将菌落进行细胞壁酶解，得到原生质体粗溶液；以及原生质体粗溶液经过滤、离心以及重悬后得到原生质体溶液。本发明提供的制备方法可快速获得大量原生质体。与现有的常规方法相比，本发明提供食用菌原生质体的制备方法速度有很大提高，并且步骤简单，操作更方便。

摘要： 本发明提供了一种杨树腐烂病病原菌原生质体的制备及其遗传转化的方法，属于分子植物病理学领域。原生质体的制备方法包括将杨树腐烂病菌接种到YEPD液体培养基中进行菌丝培养，然后将杨树腐烂病菌菌丝进行酶解处理，即得。且利用PEG介导的方法对制备的原生质体进行遗传转化，获得突变体。本发明方法制备原生质体效率高，酶解后的原生质体可高达10