重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

摘要

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K-rPA,并在毕赤酵母中进行表达.方法用限制性内切酶BamH I 和Not I将含有rPA全长基因的质粒pJZ16双酶切后,克隆至酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母重组表达质粒.rPA基因经DNA序列测定准确无误.通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS115,PCR鉴定阳性酵母转化子,将rPA基因整合入酵母基因组DNA,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达.表达产物进行SDS-PAGE、Western-blots以及溶纤维蛋白活性检测.结果表达产物以胞内包涵体的形式存在,未糖基化.SDS-PAGE 结果显示表达蛋白质的相对分子量约为39 kD.Western-blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应.包涵体经8 mol/L脲溶液溶解后,有明显的溶纤维蛋白活性.结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达.