山羊重组促卵泡素（FSH）及其长效类似物基因在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

摘要

FSH对配子的发生、分化、成熟及与生殖有关的行为的发生都起着重要的作用。FSH制剂可广泛的应用于动物的生殖调控，提高其繁殖潜力，也可在人类辅助生殖临床上诱导排卵，治疗生殖方面的疾病。重组FSH可避免天然激素制剂在应用过程中的不足，为FSH的高效、广泛的应用带来了契机。本研究在获得山羊FSH及其长效类似物基因cDNA序列的基础上，构建其酵母表达载体在巴斯德毕赤酵母中进行稳定的表达，为高效表达重组FSI-I及其长效类似物基因提供了必备的条件。 根据FSH及其长效类似物基因序列和酵母表达载体的特点，设计了含有相应酶切位点和可以去掉目的基因信号肽的特异性引物，分别以pVITRO-FStα,β-CTP，pVITRO-FSHβ．CTP-α为模板，PCR．扩增获得含有特异性酶切位点的FSHα、FSHβ、FSHβ-CTP、FSHβ-CTP-α。将扩增的目的基因与载体pPIC9K和pPICZα A经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后，再进行连接和转化构建含有目的基因的酵母表达载体，经PCR和测序验证正确后大提酵母表达载体。将纯化的酵母表达载体经酶切线性化后，再进行纯化和浓缩使其浓度为0.5～1μg、mL后，采用电转化的方法将含FSH Q的载体分别与含有FSHβ、：FSHβ-CTP的载体共转化到感受态的酵母细胞的基因组中，而含有FSHβ．CTP-α的载体单独转化到感受态的酵母细胞的基因组中；然后采用营养缺陷型的培养基、含抗生素的培养基及PCR．的方法筛选阳性酵母转化子His<'+>及高拷贝转化子，再利用MM和MD培养基筛选甲醇利用快型菌落Mut<'+>。将His<'+>Mut<'+>型转化子接种于BMGY培养基获得生物量的菌体后，再用含0.5％甲醇的BMMY培养基诱导表达，每间隔24h取一次表达上清进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot鉴定，然后用放射免疫的方法测定FSH的表达量。 结果显示表达蛋白的分子量：FSH αβ约为27KD、FSHαβ-CTP约为28KD、FSHαβ-CTP-α约为29KD，与预期的大小一致，FSHβ为22KD糖基化高一些，高浓度G418筛选的高拷贝转化子的表达量比低浓度G4．18筛选的菌落的表达量显著的高，FSH长效类似物基因的表达量显著高于FSH基因的表达量，表明CTP结构具有促进基因表达的功能。 本次实验成功的构建了FSH及其长效类似物基因的巴斯德毕赤酵母表达载体，并在GS115中成功的进行了表达，为进一步开展FSH及其类似物的研究和应用奠定了基础。

目录

摘要

前言

材料与方法

1材料

1.1质粒、菌株、主要试剂

1.2培养基与常用溶液配方

1.3主要实验仪器

2方法

2.1 FSH及其长效类似物基因酵母表达载体的构建

2.2阳性克隆载体电转化到毕赤酵母中

2.3阳性酵母菌落的筛选、判型与鉴定

2.4巴斯德毕赤酵母阳性菌落的诱导表达

2.5表达产物的SDS-PAGE凝胶检测

2.6 Western-blot检测表达的蛋白

2.7放射免疫检测蛋白的表达量

结果

1.FSH及其长效类似物基因酵母表达载体的构建

2.阳性酵母菌落的筛选、鉴定与判型

3巴斯德毕赤酵母阳性菌落的诱导表达及检测

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文