单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究

摘要

目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能.方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株.采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况.提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证.结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株(69.6％)检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株.Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml；而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml,4 μg/ml、2 μg/ml和0.5μg/ml.在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关.在对照组和转入pEASY-E1- Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为8μg/ml,而转入pEASY- E1- Rv2936和pEASY-E1- Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16μg/ml.结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因.